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    婦科補腎養血保胎方對先兆流產大鼠免疫細胞因子及凝血功能的影響
    添加時間: 2021/7/25 13:40:40 來源: 作者: 點擊數:

    報告正文

    一、立項依據與研究內容

    (一)項目的立項依據

    近年來,隨著工作學習壓力的不斷增加及社會、生活環境的改變,先兆流產的發病率逐年升高[1],不但損害了患者的身心健康,而且還增加了反復流產的機率,因此,有效防治先兆流產,凸顯臨床研究價值。針對病因,西醫采取了藥物、手術等治療手段,治療取得一定效果,但是結果不甚滿意,醫學界普遍認識到中醫藥治療本病的潛在優勢,從而對中藥治療本病獨特的機理進行廣泛的研究。隨著科學進步,科學家發現母體細胞因子在人類的妊娠過程中起重要作用,貫穿胚[2]胎植入到分娩的全過程。目前大多數學者將Th1/Th2型細胞因子介導的免疫反應描述為Th1型免疫反應和Th2型免疫反應。細胞因子在病理妊娠丟失中有著重要作用。Th1細胞因子一般對妊娠有害,而Th2細胞因子能維持妊娠起著積極作用。兩者之間的平衡在維持正常妊娠方面起著重要的作用。平衡一旦被打破,將導致流產的發生。中醫藥用于保胎治療已有幾千年的歷史,近年來隨著細胞因子與先兆流產關系研究的深入,現代各專家對先兆流產進行了辨證論治、專方專藥、辨證與辨病相結合的研究,安胎后代的追蹤以及對安胎機理的實驗研究。中醫藥作用機理一部分因素是否是通過細胞因子引起的免疫應答也成了研究的熱門內容。中醫把先兆流產定義為“胎漏”“胎動不安”,歷代醫家重視對胎漏、胎動不安的研究。早在漢代《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治》就提出安胎養胎的當歸散和白術散,分別代表了一熱一寒的安胎方。明代《景岳全書·婦人規》強調辨證論治安胎,并首先提出了動態觀察“腹痛、下血、腰酸、下墜”胎動不安四大癥狀的輕重變化,預測胚胎存活與否,以決定安胎抑或下胎,完善了相關妊娠病“治病與安胎并舉”和“下胎”兩大治則,F代中醫多認為導致胎動不安、胎漏的主要病機是沖任損傷、胎元不固。常見的病因病機有腎虛、血熱、氣血虛弱和血瘀。

    婦科補腎養血保胎方是丁氏婦科第十代傳人、全國第六批老中醫藥專家學術繼承指導老師丁麗仙教授多年治療先兆流產的經驗方,臨床療效顯著。婦科補腎養血保胎方由黨參、黃芪、炒白術、白芍、桑寄生、菟絲子、杜仲、續斷、阿膠珠、砂仁、仙鶴草等組成,是丁氏婦科第十代傳人丁麗仙教授安胎經驗方,主治因先天稟賦不足、或孕后不節房事、或房勞多產、或大病久病等所致腎氣虧損、氣血兩虛、沖任不固之先兆流產!端貑枴吩唬“腎者,......精之處也”,“夫精者,身之本也”,“生之來,謂之精”。腎藏精,主生長發育和生殖,腎所藏之精,有先天、后天之分,先天之精是構成生命的本原,形成胚胎的重要物質,是人體生長發育生殖的物質基礎;先天之精依賴后天之精的充養而日漸充盛,以充分發揮其生理效應。胞宮主孕育胎兒,沖為血海,任主胞胎,沖任之本在腎,《婦人規·胎漏篇》說“沖任之本在腎,如腎氣不盛,則沖任不固”“胞絡者,系于腎”腎精腎氣充盛,胞胎穩固。《傅青主女科》說:“脾健則血旺而蔭胎”,此為補腎養血保胎方的組方依據。其中黨參、黃芪、炒白術、甘草,健脾益氣、養血安胎;桑寄生、菟絲子、枸杞、續斷、杜仲補腎氣益精血、固攝沖任;阿膠珠補血安胎;砂仁和胃理氣安胎;仙鶴草收斂止血;白芍養血柔肝,合甘草,緩急止痛。全方脾腎雙補,益精養血,氣血足則胎自安。現代藥理研究表明,菟絲子增加大鼠腺垂體、卵巢、子宮臟器重量,提高HCG、黃體生成素LH受體功能,改善生殖內分泌[6]。黃芪可提高免疫球蛋白、促進抗體產生,增強T淋巴細胞,對免疫功能有雙向的調節作用,能恢復紊亂的免疫機能[7]。川續斷、菟絲子、桑寄生、阿膠珠合用可上調IL-4、IL-10細胞因子含量,下調IL-2、IFN-γ水平,調整Thl/Th2細胞的失衡[8]。

    《婦人大全良方·胎動不安方論》有云:“妊娠下血,?6?7?6?7食少氣倦,此氣虛不能攝血也”。婦女孕后,素體陰虛,陰血養胎,腎精愈虧,心肝失養,肝血虧損,肝陽上亢,沖任失調,胎氣受損,則引起胎漏、胎動不安;或者婦女情志不遂,久郁傷肝,肝氣不舒,肝郁化火,熱從內生,迫血外溢,亦能導致木克脾土,脾氣虛弱,統攝無權,沖任不固,陰血溢出于胞宮,均會導致胎漏、胎動不安的發生!陡登嘀髋啤吩唬骸胺蝠B胎半系于腎水,然非肝相助,則腎水實有獨立難支之勢,故保胎必滋腎水,而肝血斷不可不顧!碧ヂ、胎動不安既有單一的病機,又常有臟腑、氣血、經絡同病,虛實錯雜的復合病機,現代醫家結合自己經驗的同時多動態觀察病機的兼夾及其變化。褚玉[2]霞教授在臨床上以在“禇氏安胎方”為基本方加減治療先兆流產,臨床效果顯著。若為子宮畸形或免疫因素引起先兆流產,臨床也按脾腎虧虛論治;若為感染因索所致,則應在固腎培脾的基礎上重用清熱安胎之品,如二花、知母、公英等;若為母兒血型不合所致,則在“禇氏安胎方”的基礎上加龍膽草、茵陳、梔子。[3]楊氏等根據名老中醫門成福臨床經驗,將胎漏、胎動不安分3型:陰虛血熱型,以養陰清熱為治則,方藥用壽胎丸加生地炭、地榆炭、黃芩、麥冬等。腎精虧虛型,補腎填精為治則,用壽胎丸加黨參、陳皮、砂仁、白術、黃芩等。外傷胎元型,用圣愈湯加減,方藥為:太子參、黃芪、當歸、川芎、川續斷、砂仁、菟絲[4]子、桑寄生、熟地黃、白芍、杜仲、三七粉。

    羥基脲能明顯抑制核苷酸的代謝,使蛋白質代謝發生相應的改變,產生虛損癥狀,如體重、體溫下降、體毛枯稿、活動遲緩、萎靡、生殖機能減退等腎虛癥狀,并出現臟器重量減輕 [9]。米非司酮爭奪孕激素受體,無孕激素支持故蛻膜變性壞死,導致發生先兆流產。研究表明:腎虛流產模型造模成功,模型組體重增長緩慢、胚胎發育不良,或胚胎丟失;保胎方可增加大鼠體重、子宮卵巢重量,對抗羥基脲所致核苷酸、蛋白質代謝異常的虛損癥狀,降低流產率,與保胎靈組相當。

    Thl細胞主要分泌IFN-γ、IL-2等,間接或直接激活巨噬細胞、T淋巴細胞及NK細胞等多種毒性細胞,損傷胚胎滋養細胞而影響胚胎發育生長。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL- 10 等引起較強的抗體反應,并介導體液免疫,對妊娠有利。常態下,Thl/Th2網絡維持著動態平衡[10]。正常妊娠中Thl/Th2型細胞應答出現生理性失衡,Th2型細胞因子占優勢;當該平衡由Th2向Thl發生偏移時,滋養細胞和胎兒受損,導致流產的發生[11]。研究發現流產鼠胎盤部位分泌的IFN-r、IL-2濃度高,IL-4, IL-10濃度低,混合淋巴細胞胎盤反應中產生的IL - 2提高了2.5倍、IFN-γ提高了55倍,證實Thl型細胞因子可直接破壞胎盤滋養細胞的生長,對胚胎的著床、發育和胎兒生存產生不良影響[12]。Chaouat [13]等研究認為IL4/IFN-γ是衡量Th1/Th2型免疫平衡的最佳客觀指標,試驗中模型組的該指標低于對照組和中藥干預組,提示保胎方的安胎機制可能與調節母-胎界面局部Th1/Th2 型細胞因子的表達有關,可能是直接調控Th1 /Th2 型細胞因子的表達,也可能為通過提高P的水平間接調節Th1/Th2 型細胞因子的表達,進而改變流產模型母胎界面Th1 /Th2 型免疫平衡,形成Th2 型免疫偏離,誘導母胎免疫耐受,維持正常妊娠。保胎方可抑制Th1細胞因子分泌,增加Th2型細胞因子的含量,糾正Th1 /Th2的比值,降低胚胎源于母體的免疫排斥而達安胎作用。此實驗結果可能與方中菟絲子、桑寄生、川續斷、阿膠珠等調節免疫因子的藥理作用有關。

    凝血功能指標PT縮短及Fbg的升高表明機體凝血機能亢進,Fbg異常升高反應血栓風險形成[14], PT、Fbg是診斷出血性疾病的主要指標。凝血功能增強是妊娠期的生理現象,凝血與纖溶過程,為胚胎著床、滋養細胞侵入及胎盤形成起重要作用。實驗中,治療各組PT時間均有延長,提示保胎方可延長PT,降低血液的粘度。血漿中含量最高的凝血因子為血漿纖維蛋白原,在凝血過程中,形成纖維網與血液有形成分共同組成血塊,當凝血、抗凝血、纖溶系統失衡,致螺旋動脈血管病變,多發性胎盤血栓形成,胚胎缺血缺氧,缺氧性細胞損傷,導致先兆流產[16]。研究結果示:保胎方、保胎靈均可延長PT,降低Fbg含量,緩解血液高凝狀態發揮保胎作用。此實驗結果可能砂仁的抗血栓形成的藥理作用有關。婦科補腎養血保胎方能改善羥基脲所致腎虛流產大鼠模型一般情況、提高體重及子宮卵巢重量、減輕對胚胎與子宮損傷的作用;可通過降低Th1細胞因子濃度,提高Th2細胞因子濃度,調整Th2/Th1的比值偏向Th2,改善母體對胚胎的免疫排斥作用;可通過延長PT、降低Fbg含量,降低血粘度發揮安胎作用。

    (二)項目的研究內容、研究目標,以及擬解決的關鍵科學問題。

    .主要研究內容

    采用腎虛先兆流產大鼠模型,隨機分為保胎方高、中、低劑量組、模型對照組、保胎靈對照組,藥物干預10天,另設空白對照組。用酶聯免疫法(ELISA)檢測血清Thl型細胞因子(IFN-γ, IL-2)、Th2型細胞因子(IL-4, IL-10)、凝血功能指標(PT、Fbg),觀察各組體重、子宮卵巢形態、胚胎數的變化。

    實驗以早孕大鼠為研究對象,用米非司酮復制先兆流產大鼠模型。妊娠第1天隨機將大鼠分為5組:將實驗動物隨機分成正常妊娠組(簡稱正常組)、模型對照組(簡稱模型組)、褚氏安胎方高劑量組(簡稱高劑量組)、褚氏安胎方低劑量組(簡稱低劑量組),黃體酮對照組(簡稱黃體酮組),每組12只。同種飼養條件下,分籠喂養。從妊娠第1天各組每日定時灌胃1次,連續8天,正常組與模型組每鼠每日按20ml/kg體重灌服去離子水;高劑量組每鼠每日按40g/kg體重灌服(相當于成人臨床用量的12.78);低劑量組每鼠每日按20g/kg體重灌服(相當于成人臨床用量的6.39);對照組每鼠每日按8.56mg/kg體重肌注黃體酮(相當于成人臨床用量的12.78)。于妊娠第7天和第8天,除了正常組,其余組均給予4mg/(kg·d)的劑量灌服米非司酮。于第9天腹主動脈采血,提取血清,用酶聯免疫法進行指標檢測,并記錄正常胚胎的數量。

    2. 研究目標

    探索該方治療先兆流產的機制,本課題以腎虛流產大鼠為模型,檢測該方干預后的免疫因子、凝血功能等指標的表達,為該方的臨床運用提供科學依據。本研究能為丁氏婦科經驗方的推廣應用、中醫藥新藥的研究奠定基礎,

    本課題在以往臨床研究的基礎上,用褚氏安胎方配成所需濃度給予早孕大鼠灌胃,通過白介素-2、白介素-4的檢測及著床胚胎數量的觀察,探索褚氏安胎方調節免疫應答、安胎的作用機理。為臨床提供客觀依據,以便本藥更好地推廣應用。

    3. 擬解決的關鍵科學問題

    觀察丁氏婦科補腎養血保胎方對腎虛型先兆流產大鼠免疫因子及凝血功能的影響,探討其安胎機制。關于止血機制、基因表達等方面的研究。

    本課題根據中醫基本理論,結合導師學術思想及現代醫學理論,并借助現代科學方法,通過動物實驗,建立先兆流產大鼠模型,從免疫學角度進一步研究褚氏安胎方治療先兆流產的機制,揭示中醫藥治療本病的作用機理,旨在研究其療效并為更有效地用于臨床治療提供依據。

    (三)擬采取的研究方案及可行性分析。

    .研究方法

    1.材料及方法

    1.1 動物  SPFSD大鼠,其中雌鼠80只,雄鼠40只,3-4月齡,體重200g-300g,湖南省長沙市天勤生物有限公司提供,許可證證號:SCXK()2014-0011,在貴陽中醫學院動物研究所適應性喂養1周。

    1.2藥物  保胎方:由黃芪、黨參、炒白術、菟絲子、川斷、桑寄生、阿膠珠、白芍、甘草、仙鶴草等組成。中藥由貴陽中醫學院第一附屬醫院提供,水煎、濃縮,置于4℃冰箱冷藏。米非司酮純粉劑:產品編號:C84-1587-1G,由廣州市齊云生物技術有限公司生產(批號:MB1587)。保胎靈:(國藥準字Z22026139)生產企業:吉林省遼源亞東有限公司。羥基脲:由北京嘉林藥業股份有限公司生產(批準文號:國藥準字1H3080239)。

    1.3儀器與試劑  微型高速離心機:C2500-R-230V美國Labnet ;全自動酶標儀:Multiskan MK3 Thermo scientific;電熱恒溫培養箱:ICV-450日本ASONE;尼康Eclipse 55i/50i生物顯微鏡;超低溫冰箱。電子天平:FA1004N電子分析天平;電熱恒溫水浴鍋:HH-4數顯雙列四孔水浴鍋,常州華冠儀器制造有限公司。大鼠γ干擾素(IFN-γ)試劑盒、大鼠白介素2IL-2)試劑盒、大鼠白介素4IL-4)試劑盒、大鼠白介素10IL-10)試劑盒、凝血酶原時間試劑盒、纖維蛋白原試劑盒等試劑均來源于武漢伊萊生物科技有限公司。 

    1.4方法及步驟

    1.4.1妊娠動物模型制備

    造模方法參照《藥理實驗方法學》[2]:連續采用陰道分泌物涂片觀察所有雌鼠動情周期2周,去除無動情周期及無穩定動情周期大鼠3只,入組有規律動情周期雌鼠77只與雄鼠按2:1合籠過夜,次晨查看雌鼠陰道栓,發現陰道栓為妊娠第1,無陰道栓者取雌鼠陰道分泌物鏡檢,如發現精子即為妊娠第1天。

    1.4.2分組與腎虛先兆流產動物模型建立

    參照《人類疾病動物模型》[3]:將交配成功的72只雌鼠隨機編號分為6個組,分別為保胎方高劑量組、保胎方中劑量組、保胎方低劑量組、保胎靈對照組、模型對照組、空白對照組,每組12只,各組之間體質量比較,差異無統計學意義。自妊娠第3天開始至第12天,除外空白組,其余各組每天下午灌胃羥基脲(450mg/kg2ml[4],并在造模第10天羥基脲灌胃6小時后,分別加灌米非司酮溶液(RU486) 3.75mg/kg溶液2ml[3],旨在誘導流產發生,模型建立完成。

    1.4.3藥物干預

    在妊娠第3-12天,保胎方高、中、低劑量組:根據動物體質量換算,早晨分別予保胎方水煎液43.12g/kg/d、21.56g/kg/d、10.78g/kg/d灌胃各2ml;保胎靈組:早晨保胎靈0.7g/kg/d灌胃,2m1/日;模型對照組:早晨生理鹽水灌胃2ml/d;空白對照組:早晨及下午均生理鹽水灌胃2ml1次,均持續10日。

    1.5 標本采集及處理

        各組大鼠妊娠第1d、第10d稱體質量。妊娠第13d(用米非司酮24小時后)以5%戊巴比妥麻醉后,摘眼球采血,3000r·min-1離心,取上層血清待測。取血后處死大鼠,摘取子宮及卵巢,剝去其脂肪,稱質量;解剖子宮,觀察子宮變化,統計正常胚胎數及流產胚胎數。

    1.6觀測指標

    1.6.1一般情況  觀察大鼠每天在形態、活動、毛色、進食量、大便等。

    1.6.2指標檢測  采用酶聯免疫法(ELISA)檢測:血清Thl型細胞因子IFN-γ、IL-2Th2型細胞因子IL-4、IL-10含量、PT、Fbg含量。

    1.6.3解剖學觀察及保胎率計算 取血后,取出孕鼠子宮卵巢,稱重,觀察外觀,剖開子宮,計數各組每只大鼠胚胎個數,通過胚胎個數之和比較推算各組療效,算出保胎率,保胎率為正常胚胎數/(正常胚胎數+流產胚胎數)。正常胚胎數、流產胚胎數的判定標準參照《人類疾病動物模型》[3]:正常胚胎:子宮粗大呈串珠狀、粉紅色,解剖后宮內未見瘀血,胚胎完好,呈粉紅色;部分流產子宮:宮腔內見瘀血,胚胎不完整,或只有胎盤母體部及胎盤胎兒部存在;完全流產子宮:母鼠體重下降明顯,子宮呈竹節樣改變,宮腔內明顯瘀血或壞死組織,或僅見到胚胎著床點,或胚胎黑褐色,或曾出現陰道出血[5]。

    1.7統計學處理  應用SPSS 16.0統計軟件進行分析和處理。

    1.7.1 計量資料:數據方差齊性,呈正態分布,采用方差分析,組間比較使用LSD檢驗,方差不齊時采用Tamhane’sT2檢驗;不符合正態分布的兩獨立樣本比較,采用Wilcoxon秩和檢驗。 

    1實驗材料

    1.1實驗動物

    選用SPFSD大鼠,未孕雌性大鼠80只,鼠齡10周,體重為197.5±16.3g,雄性大鼠40只,體重為218.9±20.8g,由鄭州大學實驗動物中心提供。許可證號:SCXX(豫)2010-0002。

    1.2飼料

    一級大鼠標準全營養飼料,由鄭州大學實驗動物中心提供,規格:40kg/袋。合格證:河南省實驗動物委員會醫動字第0002331

    1.3實驗用藥

    (1)褚氏安胎方(以下簡稱CSATF)藥物組成:川斷、杜仲、菟絲子、太子參、黃芩、白術、阿膠、旱蓮草、蘇梗、砂仁、炙甘草,每付中藥重188克,將上藥煎成分別含生藥量為2g/ml的浸膏(由河南省中醫院制劑中心提供),放冰箱4℃保存。

    (2)米非司酮片25mg/片,北京紫竹藥業有限公司國藥準字號:批號

    (3)黃體酮注射液1ml:20mg浙江仙琚制藥股份有限公司國藥準字號:批號:120401

    (4)生理鹽水250ml/瓶,山東華魯制藥有限公司生產。

    (5)水合氯醛,上;瘜W試劑制藥廠,批號:

    1.4實驗器材

    載玻片,灌胃器,1ml、10ml注射器,移液器,試管架、試管、離心管、手術剪、鑷子、組織剪、止血鉗、直鑷、眼科剪、大鼠固定板、無菌棉簽,一次性橡膠手套、口罩、帽子等。

    1.5主要試劑及儀器

    大鼠白介素2ELISA試劑盒:由上海研生生化試劑有限公司提供,批號為:GS-E10002大鼠白介素4ELISA試劑盒:由上海研生生化試劑有限公司提供,批號為:GS-E10142光學顯微鏡:OLYMPUSBH227561-6-材料與方法電子天平:博達ACS-3BC精密天平:BS223德國220g/1mg離心沉淀機:LXJ-64-01冰箱:海爾

    2實驗方法

    2.1實驗條件、分組實驗室環境符合普通級動物實驗室要求,室溫20℃左右,濕度65±5%;通風、清潔,飼料、供水充足,安靜。所有大鼠適應性飼養1周,動物分籠飼養,每日定時大鼠體重變化情況。對雌鼠每日清晨8:00做陰道涂片檢查,光鏡下見大量陰道脫落細胞,并至少觀察兩個穩定動情周期的為合格動情雌鼠。將選取合格的雌鼠與雄鼠以2:1雌雄合籠,次晨陰道涂片鏡檢有大量精子者或有陰道栓者為妊娠第1d。最終選定60只符合要求的孕鼠,隨機將60只孕鼠隨機分為5組,正常組12只,模型組12只,CSATF高劑量組12只,CSATF低劑量組12只,黃體酮組12只。

    2.2給藥方法妊娠第1天至第8天開始各組大鼠給藥方法如下:(1)正常組:每鼠每日按20ml/kg體重灌服去離子水。

    2)模型組:每鼠每日按20ml/kg體重灌服去離子水。(3CSATF高劑量組:每鼠每日按40g/kg體重灌服(相當于成人臨床用量的12.78)。(4CSATF低劑量組:每鼠每日按20g/kg體重灌服(相當于成人臨床用量的6.39)。(5)黃體酮組:每鼠每日按8.56mg/kg體重肌注黃體酮(相當于成人臨床用量的12.78)。因操作失誤,模型組與高劑量組于第2天各死亡1只。

    2.3先兆流產模型的建立于妊娠第7天和第8天分別按4mg/(kg·d)的劑量灌服米非司酮,誘發先兆流產,第9天進行觀察。若大鼠陰道大量或者少量出血,解剖后子宮呈“竹節狀”,腫大,宮腔內胚胎呈黑褐色,或子宮暗紫,雖未瘀血但無胚胎,即視為成功先兆流產模型。

    2.4指標的觀察與檢測(1)孕鼠一般情況觀察:精神狀態、毛色、進食等情況。

    2)于妊娠第9天上午9點以10%水合氯醛經腹腔麻醉,劑量0.3ml/100g。麻醉滿意后,在無菌條件下從腹主動脈取血5-8ml4℃,2000/分鐘速度下離心15分鐘),用移液器吸取血清,分裝置于-20℃冰箱中備用。采用采用酶聯免疫分析法測定,具體-7-褚氏安胎方對先兆流產大鼠模型細胞因子影響的實驗研究操作方法嚴格按照試劑盒說明書執行。無菌條件下摘取大鼠子宮,稱重并記錄其著床胚胎數。

    2.5統計學處理

    所有數據均采用Spssforwindows(ver18.0)軟件進行統計處理,多組間比較用單因素方差分析,計量資料結果以均數(x)±標準差(s)表示。P<0.05為差異有顯著性意義,P<0.01為差異極顯著。

    .關鍵技術說明:

    4.1動物模型的研究

    目前,米非司酮、米索前列醇、溴隱亭、催產素等常用于復制先兆流產模型。米非司酮是一種孕激素受體(PR)拮抗劑,其與PR的親和力是孕酮的5倍,進入體內后能有效地競爭PR,影響孕酮在其靶器官的生理功能表現,抑制脾細胞分泌合成孕酮誘導阻斷因子(PIBF),阻斷孕激素在靶器官發揮生理效應,進而具有抗著[21]床、終止早孕的效果。米索前列醇可促進子宮平滑肌收縮,軟化宮頸,使壞死[22]胚胎及胎盤組織排出宮腔外,但與胚胎的死亡無直接關系。時彥等研究γ干擾素(IFN-γ)IL-4等細胞因子在流產過程中發揮的作用及其機制,于孕6-8d每天腹腔注射溴隱亭0.3mg/kg,連續3d,成功復制溴隱亭致先兆流產大鼠模型,由于此方法采用腹腔注射,容易對大鼠血管、胚胎等造成直接的損傷或死亡,對[23]結果形成干擾,故本實驗未采用此方法。朱斌娥在制備大鼠先兆流產模型,于大鼠妊娠第1天用骨折器造成雙后肢股骨上端封閉性骨折,而后每天扭斷骨折處,加重損傷,持續至妊娠第11天,由于此種方法不易操作,每只動物對疼痛不易量[24]化,故本實驗未采用次方法。寧艷等采用羥基脲和米非司酮建立腎虛黃體抑制大鼠流產模型:從妊娠第1天始至第l天灌服羥基脲蒸餾水溶液,于妊娠第10天灌服米非司酮(3.75mg/kg)1次,制備腎虛流產模型,此種方法是種復合模型,與[25]本實驗的目的不一致,故未采用。張晉峰等采用針刺和催產素制小鼠流產模型,方法:雌、雄小鼠以21合籠交配,于小鼠妊娠第9日將各組孕鼠頭下垂倒置,用電針刺激兩側三陰交加合谷穴,使小鼠發生不自主的跳動到驚厥,持續30分鐘,次日肌肉注射催產素2u/kg,誘發流產,此種方法流產成功率高,但是大鼠穴位不宜選擇,電針操作過程復雜,大鼠不宜配合,故本實驗未選用此方法。張艷等-20-理論探討[26]于大鼠妊娠第7天開始分別按4mg/(kg·d)的劑量灌服米非司酮,連續2天,第9天進行觀察,成功復制大鼠先兆流產模型。由于張艷的造模方面簡便可行,易于操作,模型成功率高,適用于動物血清白介素水平等的研究,故本實驗使用該造模方法進行復制先兆流產大鼠模型。

    4.2造模藥物的選擇

    本動物實驗成功的關鍵是各種實驗條件的具備,以及造模的藥物的選擇,而實驗中所選藥物米非司酮是經過醫學界學者不斷實踐基礎上的成果,因此經過多方面研究選定米非司酮作為先兆流產模型制作的藥物。研究表明米非司酮(RU486)能使Th2型細胞因子的分泌量減少,增加Thl型細[27]胞因子的分泌,啟動流產。RU486PR的親和力是孕酮的5倍,是一種孕激素受體(PR)拮抗劑,能夠有效地競爭PR,影響孕酮在其靶器官的生理功能表現,促進脾細胞的合成分泌孕酮誘導阻斷因子阻斷孕激素在靶器官的生理效應,具有流產作用。RU486可通過影響母體生殖軸的各器官,誘導中期黃體溶解,使輸卵管的運動節律、形態失常,致受精卵不能適時到達宮腔,且能使子宮內膜由增生期向分泌期轉變,使之與胚泡的發育不同步,影響子宮內膜對受精卵的容受性從而干擾受精卵的著床,終止早期妊娠。4.3CSATF對孕鼠外周血中IL-2IL-4的作用Thl細胞主要介導細胞免疫及局部炎癥反應,能促進巨噬細胞活化,介導強[28]烈的遲發型超敏反應,具有胚胎毒作用。IL-2Th1細胞生長的必需因子和自分泌因子,在靜止狀態下,IL-2的產生主要由接觸有絲分裂原或抗原后所促發,同時在其他刺激因素下達到最大效應。這種反應能夠激活靜止的T細胞包括DNA合成及細胞分裂。IL-2不但調節了T細胞的活性,并與其他因子一起,與有絲分裂原、抗原及抗免疫球蛋白抗體結合,影響B細胞增生及可產生抗體的漿細胞。IL-2主要分布于細胞滋養細胞、早孕絨毛合體滋養細胞和早孕蛻膜細胞胞漿中,在早期妊娠母胎界面中發揮著重要的作用,是確保正常免疫功能的必要因子,主要介導細胞免疫,有免疫殺傷作用,但過多的表達,其免疫殺傷作用將促進巨噬細胞活化、細胞毒作用,能夠誘導吞噬細胞進入胎盤部位,從而損傷胎盤滋養層細胞,對滋養層的生長起到抑制作用,阻滯了胚胎的發育及胎盤功能而導致流產。Th2細胞主要是介導體液免疫反應,促進肥大和嗜酸細胞分化,促進抗體形成,從而抑制免疫炎癥,減少因此引起的過度損傷。Th2細胞因子中的IL-4有保護胎盤的作用,它可抑制淋巴因子激活殺傷細胞發生,減少鼠T細胞上IL-2受體表達及人T細胞上IL-2生成,調節單核細胞功能,減少IL-1及腫瘤壞死因子生成的作用;IL-4在子宮胎盤中還可抑制NK細胞黏附于血管內皮細胞及其進一步的聚集和活化,并抑制由IL-2誘導的IL-2NK細胞激活對滋養層細胞的損傷,抑制-21-褚氏安胎方對先兆流產大鼠模型細胞因子影響的實驗研究免疫炎癥,具有免疫營養作用,誘導Th0細胞向Th2細胞分化,從而有利于早期妊娠胎盤細胞的生長分化。因此,如何提高Th2細胞因子的水平,下調Th1細胞因子的水平,達到呈Th2反應型的動態平衡是治療先兆流產的關鍵。由實驗可知,正常組、高劑量組、低劑量組與黃體酮組先兆流產大鼠血清IL-4水平均高于模型組,差異顯著,具有統計學意義(P<0.01,高劑量組大鼠IL-4水平與黃體酮組比較,雖無統計學意義,但平均水平有升高趨勢,故CSATF有升高孕鼠血清IL-4水平的作用,功效可能與黃體酮相當,表明CSATF能夠促進胎盤細胞的生長分化;高劑量組、低劑量組與黃體酮組IL-2水平均低于模型組,差異顯著,具有統計學意義(P<0.05),表明CSATF有降低孕鼠血清IL-2水平的作用,能夠抑制滋養層細胞的損傷,對胎盤功能起到保護作用;由于中藥高劑量組與低劑量均有升高IL-4水平,降低IL-2水平的作用,與模型組比較,差異顯著,有統計學意義(P<0.01P<0.05);根據各組胚胎數量的統計,正常組、高劑量組、低劑量組與黃體酮組胚胎數量明顯多于模型組,差別具有統計學意義(P<0.01),可知CSATF可使先兆流產大鼠Th1/Th2細胞因子平衡向Th2的方向偏移,從而有利于妊娠的繼續,降低了流產率。綜上可知,CSATF可明顯提高流產大鼠模型血清中IL-4水平,降低IL-2的水平,使Th1/Th2細胞因子平衡向Th2的方向偏移,保持Th1/Th2細胞因子動態平衡,使先兆流產動物胚胎數增加,增強其對外界的抗干擾能力,從而保護胚胎免受內外環境的損害,提高先兆流產保胎成功率。

    組方與方義

    分析:方中川斷味苦,辛,性微溫,具有補肝腎,強筋骨,調血脈,續折傷,止崩漏的功用;杜仲味甘微辛,性溫,具有補肝腎,強筋骨,安胎之功效;菟絲子味甘,性溫,滋補肝腎,固精縮尿,安胎,明目,止瀉;三藥共奏補肝腎益精、養血安胎、固攝沖任之效,腎旺自能蔭胎,導師認為菟絲子非但能直接補腎,又能滋肝陰而補腎,補而不燥,因肝腎同源,母體陰虛必傷及肝血,而進一步導致腎虛,胎元不固,正如《傅青主女科》曰:“夫養胎半系于腎水,然非肝相助,則腎水實有獨立難支之勢,故保胎必滋腎水,而肝血斷不可不顧!彼陨蒲a腎者必先養肝,故重用為君;太子參味甘,微苦,性平,補益脾肺,益氣生津;白術味甘、苦,性溫,具有健脾益氣,燥濕利尿,止汗,安胎的功效,兩藥共同補脾氣,健胃,安胎,是以后天養先天,生化氣血,先后天同補,加強安胎之功,補氣安胎前人多用黨參,但是黨參偏溫燥,補氣之中易助熱傷津,而用太子參補氣、養陰、生津,補氣而不傷津,更顯其妙,黃芩味苦,性寒,具有清熱燥濕,瀉火解毒,止血,安胎之功效,阿膠味甘、平,具有補血,滋陰,止血,潤肺的功能,旱蓮草味甘、酸,性涼,具有涼血、止血、滋補肝腎、清熱解毒之效,五藥相協,具有健脾益氣,養陰清熱,止血安胎,共為臣藥;蘇梗味辛,性溫,具有理氣寬中,止痛,安胎之功,砂仁味辛,性溫,具有化濕開胃,溫脾止瀉,理氣安胎之功,兩藥合用,理氣和胃安胎,以防諸藥滋膩,為佐藥;炙甘草調和諸藥為使。全方共奏補腎培脾,養陰清熱安胎之效。

    3.4單味藥研究:川斷:味苦、辛,性微溫。歸肝、腎經。具有補肝腎,強筋骨,調血脈,續折傷,止崩漏的作用。用于腰背酸痛;肢節痿痹;跌撲創傷、損筋折骨、胎動漏紅、血崩、遺精、帶下、癰疽瘡腫。酒續斷多用于風濕痹痛,跌撲損傷。鹽續斷多用于腰膝酸軟!睹t別錄》指出:“婦人崩中漏血,金瘡血內漏,止痛生肌肉,及腕傷惡血腰痛,關節緩急!薄侗静萁浭琛吩疲骸按〝酁橹翁ギa、續絕傷、補不足、療金瘡、理腰腎之要藥也!爆F代藥理研究作用有:1.抗維生素E缺乏癥;2.止血、鎮痛作用:對癰瘍有排膿、止血、鎮痛、促進組織再生的作用。中醫理論結合現代醫學研究都顯示了川斷的良好的保胎作用。杜仲:味甘、微辛,性溫。歸肝、腎經,具有補肝腎,強筋骨,安胎之功效。治腰脊酸疼,足膝痿弱,小便余瀝,陰下濕癢,胎漏欲墮,胎動不安,高血壓!渡褶r本草經》曰:“主腰脊痛,補中益精氣,堅筋骨,強志,除陰下癢濕,小便余瀝!薄端幮哉摗吩疲骸爸文I冷臀腰痛,腰病人虛而身強直,風也。腰不利加而用之!薄侗静菡吩唬骸芭訉m,安胎氣!薄吨腥A人民共和國藥典》:“補肝腎,強筋骨,安胎。用于肝腎不足,腰膝酸痛,筋骨無力,頭暈目眩,妊娠漏血,胎動不安!倍胖偈敲F滋補藥材,其有效成分中除了含有大量已知活性的藥用成分外,還含有多種營養物質,營養物質是杜仲保健作用的重要物質基礎。杜仲具有補肝腎,強筋骨,清除體內垃圾,加強人體細胞物質代謝,防止肌肉骨骼老化,平衡人體血壓,分解體內膽固醇,降低體內脂肪,恢復血管彈性,利尿清熱,廣譜抗菌,興奮中樞神經,提高白血球數量,增強人體免疫力等顯著功效。菟絲子:味甘,性溫。歸肝、腎、脾經。具有補腎益精,養肝明目,安胎,止瀉之效。用于腎虛腰痛,陽痿遺精,尿頻,宮冷不孕,肝腎不足之目暗不明,脾腎陽虛之便溏泄瀉,以及腎虛胎動不安之之功效;外治白癜風。菟絲子善補而-18-理論探討不竣,是平補腎陰陽之品。羅元愷教授亦認為菟絲子為補腎安胎的首選藥物,此藥既補陽,又能補陰,不辛燥,不滋膩!渡褶r本草經》曰:“主續絕傷,補不足,益氣力肥健”,“久服明目,輕身延年”!渡綎|中藥》:“治婦人常習流產!薄侗静萁浭琛吩唬骸拜私z子補脾腎、肝經之要藥”,F代研究表明,菟絲子含有多種維生素,可以補充胎兒及母體之不足。太子參:味甘、微苦,性平。歸脾、肺經。具有補益脾肺,益氣生津之功用。治肺虛咳嗽,脾虛食少,心悸,怔忡,水腫,消渴,精神疲乏。太子參味甘、微苦而性平,偏微寒,既能益氣,又可養陰生津,且藥力平和,為一味清補之品,適用于脾肺虧虛、氣陰不足、氣津不足諸癥!蛾兾髦胁菟帯罚骸把a氣益血,健脾生津。治病后體虛,肺虛咳嗽,脾虛腹瀉,小兒虛汗,心悸,口干,不思飲食!秉S芩:味苦,性寒。歸肺、膽、脾、胃、大腸、小腸經。具有清熱燥濕,瀉火解毒,止血,安胎,降血壓之功效。用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡,濕熱痞滿,瀉痢,黃疸,肺熱咳嗽,高熱煩渴,血熱吐衄,癰腫瘡毒,胎動不安?共≡w、抗炎、調節免疫功能、解熱、鎮靜、保肝、利膽等!侗静輬D經》:“及主妊娠安胎散,亦多用黃芩”朱震亨曰:“黃芩、白術乃安胎圣藥,俗以黃卒為寒而不敢用,蓋不知胎孕宜清熱涼血,血不妄行,乃能養胎,黃芩乃上、中二焦藥,能降火下行,白術能補脾也!薄侗静菥V目》也有云:“黃芩得白術安胎!卑仔g:味苦、甘,性溫。歸脾、胃經。具有健脾益氣,健胃,燥濕利尿,化痰,止汗,安胎之功效。

    .技術路線(見下圖)

    4.可行性分析

    (四)本課題的特色與創新之處

    根據先兆流產病人的生理特點,導師確立了中醫治療先兆流產的大法,即“補腎培脾,養陰清熱安胎”,與此同時也注重病人日常生活的起居飲食與心理輔導,在診治疾病的同時積極與患者交流。導師治療本病辨病與辯證相結合,根據四診情況強調辨證論治安胎,并結合《婦人規》所載“腹痛、下血、腰酸、下墜”胎動不安的輕重變化癥狀,來判定胚胎的發育情況,以確定積極安胎,或者胎兒預后不良絕不姑息安胎,告知病情,讓病人做下胎準備,以免貽誤病情。正如《婦人大全良方》所載:“妊娠羸瘦,或挾疾病,臟腑虛損,氣血枯竭,既不能養胎,致傷胎氣不固,終不能安者,可下之,免害妊婦!笨芍獙煄煿哦痪心嘤诠,在不斷學習實踐中與時俱進。導師認為妊娠初始之脈當滑數有力,按之應手,一派氣血沖和之象,如此孕婦先天腎氣充實,后天脾胃健旺,面色紅潤,目光有神,聲音洪亮,舌紅,胎薄白,是以氣血充養,胎元固,雖有簡單勞作,未能見有胎墮者。然體弱多病者,或者;ゲ辉姓,其脈多沉弱無力,或久按無力,腎脈按之多細弱短小,病人多陳述腰酸乏力、納眠差或有陰道下血,從外可見病人面色黯淡無光澤,語聲低微,目光少神,少動,舌黯淡,舌體或者胖大或者瘦小,胎黃厚或黃燥;其腎氣必弱,無陽則陰無以生,腎陰隨之虧損,陰虛則內熱從中生,部分孕婦會減衣多飲水,仍覺燥渴難忍,根據五行相生的規律,水能生木,腎中陰水即耗,木難以生,肝血不足,虛陽易動,肝陽上亢者,輕者擾亂情志,重者發為子癇;先天不足須后天充養,奈何脾胃已虛,即使每日佳肴美味,或不欲食,縱使入于體內,胃弱不能腐熟,脾虛不能運化水谷,氣血無以生,津液無以化,反阻礙氣之通降,血之運行,久之胃氣不得已降,腑氣不得已通,氣血必瘀滯,水飲停于內,然胎兒自不能生化氣血供己發育,全賴母體氣血供養,此時母體不能自養,何有余氣血供給胎兒,胎兒得不到供養,引起“腹痛、下血、腰酸、下墜”等癥狀,若不能母病不愈,胎最終不保。再結合導師自擬褚氏安胎方,無不體現辨證之精髓,用藥之巧妙。隨著生活水平的提高,人們越來越關注自身的健康,若婦女獲珍貴兒,或者心情不舒,加之出現流產之先兆,必生疑慮,擔驚受怕,多不利于疾病的治療,導師察病亦察心,深知情緒會導致疾病進一步加重,每每遣方用藥的同時,給予心理疏導,引導其生活起居,避外邪,順氣候,正所謂天人相應,體現了中醫的整體觀。結合現代醫學研究,胎兒作為母體一異物,部分母體會有一定排異反應而引起流產的發生,師多建議病人保胎至少三個月,未見不適癥狀出現,方可停藥觀察,跟師坐診隨訪可知,保胎足三個月極少有不明原因流產者,從臨床實踐中認證了導師的理論符合實際,證實了導師理論的精準,褚氏安胎方的良好效果。

    (五)年度研究計劃及預期研究結果

    1.年度研究計劃

    2. 預期研究結果

    2.結果

    2.1 保胎方對各組大鼠一般情況的影響

    空白對照組大鼠一般狀態良好,反應靈活,毛色光滑,飲水進食增加,大便正常。模型對照組從第2天開始出現拱背、蜷縮,且逐漸出現進食量減少、大便稍稀、被毛疏松。保胎方高、中劑量組及保胎靈組大鼠均有輕微少動、拱背、被毛疏松現象。保胎方低劑量組少數大鼠出現蜷縮少動、拱背、被毛疏松表現,出現時間較模型組晚,飲水量與進食量無明顯增加。

    2.2  保胎方對大鼠體重及子宮卵巢重量的影響

        體重變化及子宮卵巢重量:與空白組比較,模型組均降低,差異有統計學意義P0.05。與模型組比較,高中劑量組、保胎靈組的體重及子宮卵巢重量均有增加P0.05),低劑量組體重變化及子宮卵巢重量均有增加,差異無統計學意義P0.05;與保胎靈比較,高中劑量組體重變化及子宮卵巢重量差異無統計學意義P0.05)。

    2.3 保胎方對大鼠胚胎數及活胎率的影響  

    空白組孕鼠子宮結節狀膨大,呈光潔粉紅色,胚胎大小均勻,發育良好,胚胎間界限清晰,組織完好;其余5組孕鼠子宮均可見瘀血,模型組胚胎有明顯瘀血痕跡和不全胚胎。  

    正常胚胎數:模型組與空白組比較,差異有統計學意義P0.05。保胎方各劑量組、保胎靈組胚胎數較模型組增加(P0.05);與保胎靈組比較,低、中劑量組的差異有統計學意義(P0.05,高劑量組差異無統計學意義P0.05)。

    活胎率:模型組與空白組比較,差異有統計學意義P0.05;保胎方高中劑量組、保胎靈組活胎率較模型組高(P0.05),保胎方低劑量組與模型組差異無統計學意義(P0.05);與保胎靈組比較,低劑量組與其差異有統計學意義(P0.05,高中劑量組與其差異無統計學意義P0.05)。(見表2

    2.4 保胎方對大鼠血清Th2型細胞因子(IL-4、IL-10/Thl型細胞因子(IFN- γ、IL-2)的影響

    從表3可知,與空白組比較,模型組的IL-2、IFN、IL-4、IL-10的濃度變化差異有統計學意義(P0.05)。與模型組比較,高中低劑量組、保胎靈組的IFN- γ、IL-2的濃度較模型組下降,差異有統計學意義P0.05;高中低劑量組、保胎靈組的IL-10濃度較模型組增加(P0.05);與模型組比較,IL-4濃度,保胎中劑量組升高,差異有統計學意義P0.1),保胎低、高劑量組較模型組增加,但差異無統計學(P0.05)。

    由表4可知,與空白組比較,模型組的IL4/IL2、IL4/IFN-γ、IL10/IL2、IL10/IFN-γ差異有統計學意義(P0.05,或P0.1)。與模型組比較,保胎方各劑量組及保胎靈組,IL4/IFN-γ、IL10/IFN-γ差異有統計學意義;中、低劑量組IL4/IL2較模型組高,差異有統計學意義(P0.05,保胎高劑量組較模型組增加,但差異無統計學(P0.05)。與模型組比較,高、中、低劑量組及保胎靈組IL10/IL2與其差異有統計學意義(P0.1)。

    2.5 保胎方對先兆流產大鼠凝血指標的影響

        與空白組比較,模型組的PT、Fbg濃度差異有統計學意義P0.05)。與模型組比較,保胎方各劑量組PT時間較長(P0.05),保胎方低、中組和保胎靈組Fbg的濃度均較。P0.05)。與高劑量組相比,中劑量組的PT、Fbg濃度差異有統計學意義(P0.05)。(見表5

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