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    業務聯系
    案例范本
    長鏈非編碼RNAGLS-AS 介導的c-Myc/GLS 通路在胰腺癌中的作用及機制
    添加時間: 2021/7/25 13:27:54 來源: 作者: 點擊數:

    中文摘要

    胰腺導管腺癌(PDAC)是惡性程度極高的腫瘤,由于其組織具有高度纖維化及缺乏血管的特征,以及癌細胞內發生的一系列代謝重編程改變,使得胰腺癌至今幾乎尚無有效的治療方法。我們在研究過程中發現谷氨酰胺酶(GLS)的反義長鏈非編碼RNAlncRNAGLS-AS)在胰腺癌中發揮著調控腫瘤發生發展的作用。同時,我們發現lncRNAGLS-AS在胰腺癌中的表達與腫瘤營養應激微環境相關。因此,本研究旨在將胰腺癌營養應激微環境與lncRNAGLS-AS聯系起來,逐步揭示lncRNAGLS-AS調控GLS表達的機制,及其如何通過c-Myc/GLS通路在營養應激微環境中介導胰腺癌細胞代謝重編程,以此為胰腺癌的治療提供新的思路以及理論基礎。

    通過高通量測序分析篩選出胰腺癌組織(PC)與癌旁正常組織(NP)差異表達的lncRNAGLS-ASAK123493.1)作為研究對象。NorthernBlot實驗檢測lncRNAGLS-AS在胰腺癌組織、細胞中的表達;通過RNA熒光原位雜交技術(RNA-FISH)明確lncRNAGLS-AS在胰腺癌細胞系BxPC-3、PANC-1中的亞細胞定位。收集武漢協和醫院胰腺癌患者手術標本,包括PC和與之對應的NP組織30對;使用熒光定量PCR技術檢測lncRNAGLS-ASGLSmRNA的表達。在胰腺癌細胞系BxPC-3PANC-1細胞中轉染lncRNAGLS-AS的小干擾RNA或過表達質粒。通過MTT實驗、平板克隆形成實驗檢測轉染后細胞的增殖活性;劃痕實驗、Transwell實驗分別檢測細胞的遷移,侵襲能力。再使用慢病毒包被lncRNAGLS-AS的小干擾RNA,包被的慢病毒在轉染PANC-1細胞后用于構建裸鼠異種移植瘤模型,以觀察轉染后細胞在體內生長、轉移能力的改變。用熒光定量PCR技術檢測胰腺癌細胞系在轉染lncRNAGLS-AS的小干擾RNA或者過表達質粒后,以及30對胰腺癌組織中lncRNAGLS-AS、GLSmRNA表達;同時用蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測GLS蛋白水平。使用RNA原位雜交(RNA-FISH)與GLS蛋白免疫熒光共染,觀察lncRNAGLS-ASGLS蛋白在胰腺癌組織與胰腺癌細胞系中共定位的情況。針對lncRNAGLS-ASGLS前體RNAGLSpre-mRNA)分別設計RNA探針,使用RNA熒光原位雜交技術對lncRNAGLS-ASGLSmRNA在胰腺癌細胞中的共定位進行檢測。通過體外轉錄技術人工合成lncRNAGLS-AS的不同部位片段,并用生物素標記,進一步用RNApulldown技術探究lncRNAGLS-ASGLS前體RNAGLSpre-mRNA)的結合位置。α-鵝膏蕈堿阻斷胰腺癌細胞系RNA合成后,觀察轉染lncRNAGLS-AS小干擾RNA或者過表達質粒對GLSpre-mRNA穩定性的影響。利用蛋白質免疫共沉淀(Co-IP)證明ADAR1Dicer在胰腺癌細胞中結合。RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)證明ADAR1/Dicer蛋白復合體與GLS-AS/GLSpre-mRNA雙鏈RNAdsRNA)復合體結合。在胰腺癌細胞系中分別使用小干擾RNA敲低ADAR1Dicer表達后,熒光定量PCR檢測lncRNAGLS-AS,GLSpre-mRNA表達水平,以及α-鵝膏蕈堿處理上述轉染細胞后GLSpre-mRNA的穩定性;WesternBlot檢測轉染細胞中ADAR1、Dicer、GLS蛋白水平。體外模擬胰腺癌組織微環境,包括低氧、酸性、低糖以及低谷氨酰胺,熒光定量PCR檢測lncRNAGLS-AS的表達,探究lncRNAGLS-AS在胰腺癌中低表達的驅動因素。RNA熒光原位雜交檢測低糖、低谷氨酰胺環境下lncRNAGLS-AS的表達水平。熒光定量PCR、WesternBlot檢測低糖、低谷氨酰胺環境中GLSmRNA及蛋白的表達。WesternBlot檢測低糖、低谷氨酰胺環境中c-Myc蛋白表達水平。染色質免疫共沉淀(ChIP)驗證c-Myc蛋白與lncRNAGLS-AS上游啟動子結合序列。雙熒光素酶報告基因檢測c-Myc蛋白對lncRNAGLS-AS啟動子轉錄活性的影響。LncRNAGLS-AS的慢病毒載體轉染BxPC-3細胞系,以慢病毒空載體作為陰性對照(LV-Vector),構建裸鼠異種移植瘤模型,觀察lncRNAGLS-AS過表達在體內對腫瘤生長、轉移的影響。

    英文摘要

    Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly malignant tumor. Due to the the pathological features of high fibrosis and vascular deficiency of pancreatic cancer, as well the metabolic reprogramming in cancer cells, there is almost no effective treatment for pancreatic cancer. The aim of this study is to investigate how our newly discovered antisense long non-coding RNA (lncRNA GLS-AS) of glutaminase (GLS) can reprogram metabolism by regulating c-Myc/GLS signaling pathway under nutrition stress microenvironment in pancreatic cancer. Our study investigated the effect of dysregulated lncRNA GLS-AS on changing tumor growth and metastasis, and revealed its novel regulatory mechanisms, which may provide new insights and theoretical bases for the treatment of pancreatic cancer.

     Differentially expressed of long non-coding RNAs (lncRNAs) in pancreatic cancer tissues were screened by next-generation sequencing. The antisense long non-coding RNA GLS-AS (AK123493.1) of glutaminase (GLS) was selected as a target of continued study. The expression of lncRNA GLS-AS and GLS mRNA was detected by real-time quantitative PCR. Northern blot analysis confirmed that lncRNA GLS-AS was expressed in pancreatic cancer tissues and cells. RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) emerged the subcellular localization of lncRNA GLS-AS in pancreatic cancer cells. Surgical specimens of pancreatic cancer patients were obtained from Wuhan Union Hospital, including 30 pairs of cancer tissues and corresponding normal tissues adjacent to each other. Small interfering RNAssiRNASsor over expression plasmid of lncRNA GLS-AS was transfected into pancreatic cancer cell lines BxPC-3 and PANC-1 cells. The proliferation activity of the transfected cells was detected by MTT assay and colony formation assay; the wound healing assay and Transwell assay were used to detect cell migration and invasion ability. Lentiviral was used to coate lncRNA GLS-AS small interfering RNA. The coated lentivirus was transfected into PANC-1 cells and used to xenograft model in nude mice to observe the growth and metastasis ability of the transfected cells in vivo. qPCR and Western Blot were used to detect the expression of lncRNA GLS-AS /GLS mRNA and GLS protein in pancreatic cancer tissues and in pancreatic cancer cells which transfected with small interfering RNA or overexpression plasmid of lncRNA GLS-AS. Simultaneously, co-staining of RNA in situ hybridization and GLS protein immunofluorescence to observe the co-localization of lncRNA GLS-AS RNA and GLS protein in pancreatic cancer tissues and pancreatic cancer cell lines. Specific RNA probes were designed for lncRNA GLS-AS and GLS precursor mRNA (GLS pre-mRNA). LncRNA GLS-AS and GLS mRNA were co-localized in pancreatic cancer cells using RNA fluorescence in situ hybridization. Fragments of different parts of lncRNA GLS-AS were synthesized by in vitro transcription technique and labeled with biotin, the biotin-labeled probes were used in RNA pulldown assay to investigate the position of lncRNA GLS-AS binding to GLS pre-mRNA. After α-amanitin blocked RNA synthesis in pancreatic cancer cell lines, the effect of transfection of lncRNA GLS-AS small interfering RNA or overexpression plasmid on the stability of GLS pre-mRNA was observed. Co-immunoprecipitation (Co-IP) was used to demonstrate that ADAR1 binds to Dicer in pancreatic cancer cells. RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) demonstrates that the ADAR1/Dicer protein complex binds to the lncRNA GLS-AS /GLS pre-mRNA double-stranded RNA (dsRNA) complex. In the pancreatic cancer cells, the expression of lncRNA GLS-AS, GLS pre-mRNA and the stability of GLS pre-mRNA after transfected with siRNAs of ADAR1or Dicer and then with treatment of α-amanitin were detected by qPCR, respectively. In vitro simulation of pancreatic cancer tissue microenvironment, including hypoxia, acidity, low glucose and low glutamine, then the lncRNA GLS-AS level was measured by qPCR, to explore why lncRNA GLS-AS low expression in pancreatic cancer. RNA fluorescence in situ hybridization was used to verify the low expression of lncRNA GLS-AS in nutrition stress environments. qPCR and Western Blot were used to detect the expression of GLS mRNA and protein in low levels of glucose and glutamine environments. Western Blot was used to detect the expression of c-Myc protein in low levels of glucose or glutamine deprivation environments. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) verified the binding sequences between c-Myc protein on lncRNA GLS-AS promoter. The dual luciferase reporter assay detected the effect of c-Myc protein on the transcriptional activity of the lncRNA GLS-AS promoter. The lentiviral vector of LncRNA GLS-ASLV-GLS-ASwas transfected into cells, and the lentivirus with empty vector was used as a negative control (LV-NC) to construct xenograft model. The effect of lncRNA GLS-AS overexpression on tumor growth and metastasis was observed.

    報告正文

    參照以下提綱撰寫,要求內容翔實、清晰,層次分明,標題突出。請勿刪除或改動下述提綱標題及括號中的文字。

    (一)立項依據與研究內容4000-8000字): 

    1項目的立項依據(研究意義、國內外研究現狀及發展動態分析,需結合科學研究發展趨勢來論述科學意義;或結合國民經濟和社會發展中迫切需要解決的關鍵科技問題來論述其應用前景。附主要參考文獻目錄);

    研究意義

    研究表明,癌細胞表現出與正常細胞不同的代謝特點。其中最為人熟知的是“瓦伯格效應(Warburg效應)”,即使在氧氣存在的情況下,癌細胞傾向于通過“有氧糖酵解”途徑利用葡萄糖[1]。因此通過有氧糖酵解產生的丙酮酸轉化為乳酸,但不轉化為乙酰-輔酶A。為了彌補檸檬酸循環不足,癌細胞通常會激活谷氨酰胺代謝[2]。因此,由于血管供應營養物質和代謝需求旺盛之間存在不足,腫瘤細胞中明顯加劇的葡萄糖和谷氨酰胺消耗,可能會導致葡萄糖與谷氨酰胺等營養物質的相對缺乏[3]。這種情況在胰腺癌中尤其明顯,胰腺癌中通常存在致癌基因Kras突變,導致癌細胞代謝重編程,消耗大量葡萄糖和谷氨酰胺以支持癌細胞旺盛生長[4-6]。因此,胰腺癌細胞的高代謝狀態和胰腺癌組織的乏血管特征,必將導致特別是由葡萄糖和谷氨酰胺消耗引起的顯著營養應激[7]。事實上,這種供需不平衡的矛盾狀態不但提供了支持癌細胞快速增殖所需的能量和代謝物的途徑,而且使得癌細胞對包括缺氧和能量缺乏在內的營養應激具有適應甚至抵抗能力[8]。有研究報道,當具有野生型KRAS等位基因的細胞在經受低萄糖環境時,雖然很少有細胞存活,但是存活的細胞大多數表達高水平的GLUT1,并且這些存活細胞中有4%獲得了新的KRAS突變,這些數據表明葡萄糖剝奪可以驅動人類腫瘤中KRAS基因突變。因此,營養應激可能是導致KRAS基因突變的有利環境[9]。有研究結果顯示,葡萄糖剝奪增加前列腺癌中VEGFmRNA的穩定性,這有助于促進腫瘤血管生成[10]。此外,Dejure及其同事的研究結果表明,谷氨酰胺剝奪的營養應激,只能抑制結腸癌細胞的增殖,并不能殺死了他們[11]。值得注意的是,腫瘤患者本身的營養缺乏狀態與患者生存率低相關,但是并不影響腫瘤在體內的生長,這表明人體的營養不良狀態,不但不會抑制腫瘤的生長以及遠處轉移,甚至可能使腫瘤細胞更強壯[12]。因此,研究胰腺癌如何通過自身代謝重編程作用,以適應營養應激的微環境及其分子機制,對胰腺癌患者治療的策略的改進至關重要。

    國內外研究現狀及發展動態分析

    反義長鏈非編碼RNAAntisenselncRNAs)是從與蛋白質編碼基因或非蛋白質編碼基因的有義鏈對側鏈轉錄而來。最近的研究結果表明,反義長鏈非編碼RNAAntisenselncRNAs)在細胞內作用機制多種多樣,涉及細胞功能調控的各個方面。這些AntisenselncRNAs通過一系列復雜的機制與細胞中DNA,RNA,蛋白質分子或它們的復合體相互作用,在轉錄前,轉錄過程中以及轉錄后的各個水平,調控基因的表達,從而影響細胞內的生物學功能。反義長鏈非編碼RNA作為染色質結構和其轉錄及轉錄后功能的重要調控分子,它們的異常表達與疾病的發生發展相關。

    研究結果顯示,人類基因組只有大約2%的基因轉錄成熟的蛋白質編碼RNA,而其中的絕大多數(70-90%)被轉錄成非編碼RNAsncRNAs)。ncRNA種類繁多,按照目前的分類有轉移長鏈非編碼RNAlncRNAs),小RNAmicroRNAs),轉移RNAtRNAs),核糖體RNArRNAs),小核RNAsnRNAs)和與Piwi蛋白相作用的piRNAs[1-5]等。長鏈非編碼RNA是大小超過200個核苷酸的一類非編碼RNA,除了缺乏蛋白質編碼潛力外,非編碼基因在進化上還具有相對保守性,具體表現為通常它們來源于比蛋白質編碼基因短的基因,而且包含外顯子序列較少[1,6,7]。另一方面,它們與蛋白質編碼基因又具有某些相似性。例如,他們是通常也是由RNA聚合酶II轉錄,并且在轉錄后存在戴帽,加尾和剪接過程[8,9]。LncRNAs的亞細胞定位可以在細胞核或細胞質,定位于細胞核的lncRNAs是參與表觀遺傳調控的重要分子[10-12]。而在細胞質中的長鏈非編碼RNA通常通過影響胞質中的mRNA的穩定性,翻譯活性[13-15],或影響結合蛋白穩定性[16],或者通過競爭性結合miRNA[17-19]等方式發揮作用,調控目標基因的表達。反義長鏈非編碼RNAAntisenselncRNAs)定義為來自蛋白質編碼基因或有義鏈的對側鏈轉錄的沒有蛋白質編碼功能的RNA[20]。反義長鏈非編碼RNA最初是在細菌中發現的[21]。在細菌中報道反義轉錄產物后不久,在真核生物中也發現并報道了數十個例子[22]。近年來,隨著基因組高通量測序的方法用于科學研究,反義長鏈非編碼RNA才在一系列物種的基因組中陸續大量發現[23-25]。一些研究表明,超過30%的基因具有反義長鏈非編碼RNA,其中大多數表達水平低于其對側有義鏈轉錄的RNA[26,27]。碼蛋白質的mRNA通常大部分積聚在細胞質中,然而,研究發現,與mRNA不同,反義長鏈非編碼RNA在細胞核中富集較多[28]?傮w來說,反義長鏈非編碼RNA通過順式調控作用或者反式調控作用兩種方式起作用發揮其生物學功能。順式調控作用是指,反義長鏈非編碼RNA與從其相同的DNA區域的基因相互作用,主要是調節基因的轉錄;而反式作用是指,反義長鏈非編碼RNA與位于遠處的基因座甚至是其他染色體DNA或者RNA序列相互作用[29,30]。反義長鏈非編碼RNA的功能非常復雜而且多樣化,它們可以在基因表達的各個階段促進或者抑制靶基因的表達水平,如X染色體失活[31,32],基因印跡[33],DNA或者組蛋白的修飾等表觀遺傳調控[12,29,34];同時,反義長鏈非編碼RNA通?梢栽mRNA合成過程的任意步驟中影響靶基因的表達,包括RNA的轉錄、編輯、剪接,核膜轉運,甚至是調控蛋白質的翻譯過程[10,35-37]。由于反義長鏈非編碼RNA幾乎在基因的每個調控水平都發揮作用,我們將從下面兩個層次討論其存在的作用機制:在轉錄水平,反義長鏈非編碼RNA通過作為蛋白質的向導或者誘餌分子,參與DNA甲基化修飾或者組蛋白修飾等染色質重塑的過程,或者與轉錄因子或者DNA結合影響基因轉錄活性;轉錄后過程,主要通過RNA-RNA或者RNA與蛋白的相互作用調控靶基因的表達。

    長非編碼RNAlncRNA)是細胞內一類重要的轉錄產物,長度超過200nt,缺乏編碼蛋白質的能力。越來越多的證據表明,lncRNAs在癌癥中表達異常并參與腫瘤的發生發展[13]。具體而言,最近有很多研究報道了lncRNA與癌癥中代謝改變之間的聯系。例如:一項研究報道,腎癌和乳腺癌細胞在能量缺乏情況下,lncRNA NBR2LKB1-AMPK信號通路的調控下表達增加,lncRNANBR2反過來與AMPK相互作用并促進AMPK激酶的活性。因此,在能量應激期間,lncRNANBR2AMPK之間形成正反饋途徑以增強AMPK信號通路的活化[14]。有學者在膀胱癌的研究中發現,LncRNA-UCA1可以通過激活mTOR-STAT3/miR143-HK2的級聯反應,促進腫瘤細胞的糖酵解[15]。Ellis及其同事的研究結果表明結直腸癌細胞中PI3K/Akt信號同路的激活,可以通過解除insulin/IGF信號通路對lncRNA-CRNDE表達的抑制作用,從而促進腫瘤細胞的有氧糖酵解[16]。LncRNA-ANRIL在鼻咽癌中表達上調,并且通過增加葡萄糖攝取和糖酵解途徑來促進癌癥進展[17]。此外,lncR-UCA1被發現可以減少人類膀胱癌中活性氧(ROS)的產生和促進線粒體谷氨酸分解[18]。然而,目前尚未有研究報道與胰腺癌營養應激偶聯的特異性lncRNA。在這項研究中,在胰腺癌中發現了一種參與胰腺癌進展的營養應激反應性lncRNA。

    谷氨酰胺酶(GLS)是一種磷酸鹽活化的酰胺水解酶,可催化谷氨酰胺水解為谷氨酸和氨,為生物提供能量和保持氮平衡,降低細胞中ROS濃度,以維持代謝穩態[19]。最近的研究表明,GLS在許多惡性腫瘤中通常高表達,并作為支持腫瘤細胞生長的致癌基因[20,21]。研究報道,與周圍非腫瘤組織相比,乳腺癌組織中GLS表達升高,并且升高程度與腫瘤分級呈正相關[20]。此外,在前列腺癌細胞中,GLS可以促進葡萄糖的攝取與三羧酸循環中的谷氨酸的利用率,從而發揮促進腫瘤生長的作用[21]。因此,在腫瘤細胞中敲低GLS表達可以顯著抑制腫瘤細胞的生長和侵襲活性[22]。Chakrabarti及其同事的研究結果表明,GLS在胰腺癌中表達顯著上調,從而促進胰腺癌谷氨酰胺代謝途徑[23]。

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    2.項目的研究內容、研究目標,以及擬解決的關鍵科學問題(此部分為重點闡述內容);

    研究內容

    1. 通過高通量測序分析篩選出胰腺癌組織(PC)與癌旁正常組織(NP)差異表達的lncRNAGLS-ASAK123493.1)作為研究對象。NorthernBlot實驗檢測lncRNAGLS-AS在胰腺癌組織、細胞中的表達;通過RNA熒光原位雜交技術(RNA-FISH)明確lncRNAGLS-AS在胰腺癌細胞系BxPC-3、PANC-1中的亞細胞定位。收集武漢協和醫院胰腺癌患者手術標本,包括PC和與之對應的NP組織30對;使用熒光定量PCR技術檢測lncRNAGLS-ASGLSmRNA的表達。

    2. 在胰腺癌細胞系BxPC-3PANC-1細胞中轉染lncRNAGLS-AS的小干擾RNA或過表達質粒。通過MTT實驗、平板克隆形成實驗檢測轉染后細胞的增殖活性;劃痕實驗、Transwell實驗分別檢測細胞的遷移,侵襲能力。再使用慢病毒包被lncRNAGLS-AS的小干擾RNA,包被的慢病毒在轉染PANC-1細胞后用于構建裸鼠異種移植瘤模型,以觀察轉染后細胞在體內生長、轉移能力的改變。

    3. 用熒光定量PCR技術檢測胰腺癌細胞系在轉染lncRNAGLS-AS的小干擾RNA或者過表達質粒后,以及30對胰腺癌組織中lncRNAGLS-AS、GLSmRNA表達;同時用蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測GLS蛋白水平。使用RNA原位雜交(RNA-FISH)與GLS蛋白免疫熒光共染,觀察lncRNAGLS-ASGLS蛋白在胰腺癌組織與胰腺癌細胞系中共定位的情況。

    研究目標

    胰腺導管腺癌(PDAC)是惡性程度極高的腫瘤,由于其組織具有高度纖維化及缺乏血管的特征,以及癌細胞內發生的一系列代謝重編程改變,使得胰腺癌至今幾乎尚無有效的治療方法。課題組前期研究過程中發現谷氨酰胺酶(GLS)的反義長鏈非編碼RNAlncRNAGLS-AS)在胰腺癌中發揮著調控腫瘤發生發展的作用。同時,發現lncRNAGLS-AS在胰腺癌中的表達與腫瘤營養應激微環境相關。因此,本研究旨在將胰腺癌營養應激微環境與lncRNAGLS-AS聯系起來,逐步揭示lncRNAGLS-AS調控GLS表達的機制,及其如何通過c-Myc/GLS通路在營養應激微環境中介導胰腺癌細胞代謝重編程,以此為胰腺癌的治療提供新的思路以及理論基礎。

    擬解決的關鍵科學問題

    1. 針對lncRNAGLS-ASGLS前體RNAGLSpre-mRNA)分別設計RNA探針,使用RNA熒光原位雜交技術對lncRNAGLS-ASGLSmRNA在胰腺癌細胞中的共定位進行檢測。通過體外轉錄技術人工合成lncRNAGLS-AS的不同部位片段,并用生物素標記,進一步用RNApulldown技術探究lncRNAGLS-ASGLS前體RNAGLSpre-mRNA)的結合位置。α-鵝膏蕈堿阻斷胰腺癌細胞系RNA合成后,觀察轉染lncRNAGLS-AS小干擾RNA或者過表達質粒對GLSpre-mRNA穩定性的影響。利用蛋白質免疫共沉淀(Co-IP)證明ADAR1Dicer在胰腺癌細胞中結合。RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)證明ADAR1/Dicer蛋白復合體與GLS-AS/GLSpre-mRNA雙鏈RNAdsRNA)復合體結合。在胰腺癌細胞系中分別使用小干擾RNA敲低ADAR1Dicer表達后,熒光定量PCR檢測lncRNAGLS-AS,GLSpre-mRNA表達水平,以及α-鵝膏蕈堿處理上述轉染細胞后GLSpre-mRNA的穩定性;WesternBlot檢測轉染細胞中ADAR1、Dicer、GLS蛋白水平。

    2. 體外模擬胰腺癌組織微環境,包括低氧、酸性、低糖以及低谷氨酰胺,熒光定量PCR檢測lncRNAGLS-AS的表達,探究lncRNAGLS-AS在胰腺癌中低表達的驅動因素。RNA熒光原位雜交檢測低糖、低谷氨酰胺環境下lncRNAGLS-AS的表達水平。熒光定量PCR、WesternBlot檢測低糖、低谷氨酰胺環境中GLSmRNA及蛋白的表達。

    3. WesternBlot檢測低糖、低谷氨酰胺環境中c-Myc蛋白表達水平。染色質免疫共沉淀(ChIP)驗證c-Myc蛋白與lncRNAGLS-AS上游啟動子結合序列。雙熒光素酶報告基因檢測c-Myc蛋白對lncRNAGLS-AS啟動子轉錄活性的影響。

    4. LncRNAGLS-AS的慢病毒載體轉染BxPC-3細胞系,以慢病毒空載體作為陰性對照(LV-Vector),構建裸鼠異種移植瘤模型,觀察lncRNAGLS-AS過表達在體內對腫瘤生長、轉移的影響。

                

    3.擬采取的研究方案及可行性分析(包括研究方法、技術路線、實驗手段、關鍵技術等說明);

    研究方法

    研究對象

    研究中涉及的患者臨床手術標本從醫院胰腺外科獲得。獲取標本前與病人及家屬充分溝,病人及家屬表示同意,并簽署知情同意書。計劃隨機選取30例胰腺癌患者的腫瘤組織以及與之配對的癌旁組織,所選取患者術前未接受化學治療或者放療。根據美國NCCN胰腺癌治療指南,對患者選取相應合適的治療方案,包括胰腺十二指腸切除術或者I125粒子植入、胃腸吻合和膽總管空腸吻合等姑息手術。手術標本通過包括手術切除獲得或者胰腺組織活檢兩種途徑獲得。在研究過程中涉及違反赫爾辛基宣言的地方。并且研究獲得醫學研究倫理委員會批準。本研究所使用的胰腺癌細胞系PANC-1、BxPC-3計劃均購自于美國模式培養物集存庫(ATCC)。

    6.實驗方法

    6.1細胞培養

    正常條件下胰腺癌細胞在37℃和5CO2環境中培養,使用完全培養基,完全培養基由90RPMI1640Gibco),10FBSGibco)組成,其中青霉素和鏈霉素的濃度為:100U/mL青霉素,和100mg/mL鏈霉素。一般使用T25細胞培養瓶培養細胞,每次加4mL培養基,每隔2-3天換一次細胞培養液。細胞貼壁生長,若覆蓋瓶壁80%-90%空間時候,則進行細胞傳代操作,其方法為:去掉細胞培養基,使用無菌PBS溶液沖洗細胞,去掉殘留培養基。接著加入2mL濃度為0.25%的胰酶,37℃條件下消化細胞約5min左右,待細胞輪廓消失變圓后加入2mL含血清的的完全培養基,然后將細胞吹打至脫落,收集細胞懸液,離心后取少量細胞回種至培養瓶中,便完成一次傳代。為長期保存細胞,通常需要凍存細胞,其方法為:取對數期生長的細胞,按照之前細胞傳代的方法操作至細胞離心去上清后。重懸細胞應使用細胞凍存液,我們的細胞凍存液配制方法為90%的胎牛血清加入10%的二甲基亞砜(DMSO),重懸后將細胞吹打均勻,再將細胞懸液吸出到凍存管中,依次在4℃,-20℃環境中各存放1h,然后加入到液氮罐中保存。凍存的細胞的復蘇步驟為:取出細胞凍存管,在37℃中快速解凍細胞凍存液,加入約10mL新鮮培養基,低速離心后丟棄出上清,將細胞接種到新鮮培養基中,放入細胞培養箱,第二天應更換一次細胞培養液,以去除未貼壁的懸浮細胞。

    建立細胞營養應激模型,谷氨酰胺剝奪模型[Glutamine-],我們用不含谷氨酰胺的完全培養基培養細胞;葡萄糖剝奪模型[Glucose-],我們從Gibco購買不含葡萄糖RPMI1640培養基,人為添加葡萄糖至濃度1mmol/L。

    6.2細胞轉染

    1.接種細胞:將細胞用胰酶消化后,含血清培養基重懸,細胞計數,將細胞按照約50000/孔的密度接種至12孔細胞培養板。將細胞培養板放置入培養箱,第二天細胞貼壁后再進行轉染操作。

    2.1.6ug需要轉染的質;蛘40pmol的小干擾RNA溶解在100uL不含血清的Opti-MEM培養基中,用槍頭輕柔混勻,室溫放置5min。

    3.同時將4ul轉染siRNA時候用量為2uL)轉染試劑Lipofectamine2000溶解于100uL不含血清的Opti-MEM培養基中,同樣用槍頭混勻,室溫放置5min。

    4.將第二步和第三步中的兩管溶液充分混合,然后室溫條件下放置約20min。同時將需要轉染的12孔板細胞,去除含血清培養基,加入800uL不含血清的Opti-MEM培養基。

    5.將上一步的混合液200uL加入到需要轉染的12孔板內,使最終體積為1mL,此時應輕柔搖動細胞培養板以避免局部濃度過高造成細胞毒性。轉染細胞在培養4-6小時后,應去掉培養基,換上含血清的完全培養基。

    6.在換培養液后的48-72小時后,可根據需要提取轉染細胞的蛋白或者RNA進行表達檢測,或進一步驗證轉染后對細胞功能的影響。

    6.3MTT實驗

    1.將轉染后的細胞消化后接種在96孔板中,每孔100uL培養基,接種細胞數目為3000/孔,每個處理組至少5個復孔,與種植細胞孔邊緣相鄰板孔加入100uL無菌PBS,防止邊緣孔因蒸發導致細胞中培養基減少,影響實驗結果。

    2.將細胞培養15天后,每天處理一塊細胞培養板,將20uLMTT溶液(5mg/mL)加入到96孔板含有細胞的培養基中,并將細胞在37℃下繼續培養4小時。然后,棄去培養基,每孔加入150uL二甲基亞砜(DMSO),在脫色搖床上避光振蕩10min左右,直到所有沉淀溶解。

    3.使用多功能酶標儀分別在490nm570nm波長測量DMSO的吸光度,在無細胞孔中加入等量DMSO做空白對照,記錄數值。

    4.在接下來的2-5天將其他培養板按照同樣的處理方法記錄OD值,以橫坐標為時間軸,縱坐標以第1天數值作為相對值“1”,繪制細胞增殖曲線,取復孔之間的平均值,每個實驗應重復三次。

    6.4克隆形成實驗

    1.取處理后需要對比增殖能力的細胞,待其在對數生長期時,用0.25%的胰酶消化,完全培養基重懸,吹打成單細胞懸液,并進行細胞計數。

    2.接種細胞至6孔細胞培養板,使細胞密度為每孔500個,搖勻,使接種的細胞在培養基中均勻分布,將細胞在培養箱中繼續培養2-3周。

    3.每天觀察細胞的生長狀態,直至細胞生長出現肉眼可見的克隆后停止。去除培養基,PBS洗凈細胞,用4%多聚甲醛固定30min,PBS洗三次,晾干后用0.1%的結晶紫染色20-30分鐘,PBS洗凈多余的結晶紫。

    4.在顯微鏡下計數克隆數目,并且拍照記錄實驗結果。

    6.5劃痕實驗

    1.細胞培養板畫線:在直尺幫助下,用記號筆在6孔板后面每隔0.5cm劃直線,每條直線均穿過同一橫排的3個培養孔。

    2.接種細胞:在6孔板每個孔中接種5*105個細胞,讓細胞貼壁后能均勻鋪在6孔板底。

    3.細胞劃痕:用消毒滅菌后的直尺做依托,盡量垂直于板底標記筆所畫直線,用10uL的小槍頭做細胞劃痕。

    4.細胞劃痕后,用PBS洗凈懸浮的細胞,換上含1%胎牛血清的完全培養基,分別于0h,12h,24h,48h時間點觀察,拍照記錄細胞劃痕處遷移圖像。

    6.6Transwell細胞侵襲實驗

    1.鋪基質膠:購買于美國BD公司的Matrigel,按照1:9的比例稀釋,將Transwell小室放入24孔板中,取40uL包被于Transwell(孔徑為8um)小室底部,應注意避免氣泡產生。將鋪膠后Transwell小室放置于細胞培養箱中放置4h,使液體膠聚合形成固體凝膠。

    2.水化基底膜:Transwell小室在接種細胞前,應去除表面凝固后多余的液體,然后每孔加入50uL無血清培養基,放置于37℃孵育半小時,去除殘留液體。

    3.接種細胞:胰酶消化目標細胞,制備細胞懸浮液,應注意細胞重懸時候應用無血清培養基,對懸浮細胞進行計數,調整細胞密度至5*105/ml。往水化好的Transwell小室上室中加入100uL細胞懸液,使每孔接種細胞數為5*104個。在放置Transwell小室的24孔板內加入600uL30%胎牛血清的完全培養基,應注意避免產生氣泡,以免影響實驗結果。

    4.培養細胞:將上述處理的細胞放入細胞培養箱(37℃,5%CO2濃度),繼續培養12h。

    5.固定、染色:將上述細胞連續培養12h后,取出小室,用4%的多聚甲醛固定細胞30min。甲醛固定細胞后將小室放置超凈臺風干,然后用0.1%的結晶紫染色30min,沖洗干凈小室,應避免將小室下層膜上細胞洗脫。用棉簽擦小心去小室上室未穿過膜的細胞,將小室放置在顯微鏡下觀察,100倍視野,取五個視野計數、圖像拍照。

    6.7蛋白免疫印跡(WesternBlot

    1.主要試劑準備

    1.110x電泳液配制:

    分別稱取Trisbase30.3g,甘氨酸144.2g,SDS10g;加雙蒸水(ddH2O),在磁力攪拌器上溶解,定容至1L,使用時直接用ddH2O稀釋至1x。

    1.210x轉膜液配制:

    分別稱取甘氨酸144.1g,Trisbase30.3g,加ddH2O,磁力攪拌器溶解,定容至1L。1x轉膜液配制:取100mL10x轉膜液,加入150mL甲醇,定容至1L。

    1.3SDS聚丙烯酰胺凝膠配制:

    SDS制膠試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司,參照說明書,我們的研究一般采用8%的分離膠,總量為15mL時,配方為:ddH2O7mL,30%丙烯酰胺(29:14mL,1.5MTris-HClpH6.83.75mL,10%SDS150uL,過硫酸銨(AP150uL,四甲基乙二胺(TEMED7.5uL。我們一般使用濃度為5%的濃縮膠,當總量為6mL時,配方為:ddH2O4mL,30%丙烯酰胺(29:11mL,1.5MTris-HClpH8.81mL,10%SDS80uL,過硫酸銨(AP60uL,四甲基乙二胺(TEMED8uL。

    2.蛋白樣品提取

    2.1組織蛋白提取

    2.1.1研磨組織:準備研缽、液氮,將收集在液氮中存放的組織取出后,切取一部分,趁組織塊還未解凍,邊研磨邊加入液氮使組織塊變得脆硬,最后將組織研磨成粉狀。

    2.1.2配制細胞裂解液:按需要量配制RIPA裂解液,在使用前數分鐘按說明書比例加入蛋白酶抑制劑PMSFCocktail(如1mLRAPA裂解液中加入100xPMSF10uL,50xCocktail20uL)。

    2.1.3將配制好的RIPA蛋白裂解液加入到研磨好的組織中,按照每250mg組織加1mLRIPA裂解液的比例。

    2.1.4待裂解液充分裂解組織蛋白后,在預冷的高速低溫離心機中4℃,12000rpm,離心5min,取上清,即得組織蛋白,可用于WesternBlot實驗。

    2.2細胞蛋白提。

    2.2.1按照需要量配制RIPA蛋白裂解液。2.2.2丟棄細胞培養基,用PBS洗三遍,去除殘留血清,將RIPA裂解液加入到細胞中(6孔板160uL/well,12孔板80uL/well),將樣本放在冰上,裂解半小時。

    2.2.3用細胞刮收集裂解產物,將裂解產物收集到1.5mLEP管中,12000rpm,4℃離心10min,收集上清,即為細胞總蛋白。

    2.3蛋白樣品濃度測定

    2.3.1配制標準蛋白:

    BCA蛋白濃度測定試劑盒購自于中國碧云天。根據說明書配制標準蛋白,濃度為25mg/mL。2.3.2配制工作液:

    工作液AB按照50:1的比例配制,注意盡量現配現用,室溫儲存時間不超過24小時。2.3.3測定蛋白濃度:取一塊96孔板,將標準蛋白按照0uL、1uL、2uL、4uL、8uL、12uL、16uL、20uL的量依次加到96孔板中;待測樣本各取2uL加到96孔板中;不足20uL的孔,應加稀釋液補足。然后向每個待測樣品孔,以及標準品孔各加入200uL配制好的工作液。放在37℃環境中孵育30min,使用多功能酶標儀在560nm測定吸光度。

    2.3.4根據標準品測出的OD值與對應蛋白量在Excel表格中繪制標準曲線,并得出蛋白濃度計算公式,再根據待測樣品的吸光度OD值,計算出待測樣品濃度。

    2.4實驗操作步驟

    2.4.1樣品準備:從組織和細胞提取的總蛋白按照4:1的比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X);然后將裝蛋白的EP管在沸水中煮5-10min,使蛋白變性。

    2.4.2配膠:根據說明書配制好分離膠與濃縮膠,過硫酸銨(AP)與四甲基乙二胺(TEMED)應在灌膠前最后加入,每面膠加5.5mL分離膠,2.5mL濃縮膠。根據需要選擇10孔或15孔數梳齒。

    2.4.3電泳:待測樣品按30ug/孔的上樣量,待測樣品兩端應加入蛋白Marker。濃縮膠電泳電壓為80V,待到溴酚藍完全進入分離膠,可調大電壓至100V。

    2.4.4轉膜:待溴酚藍達到分離膠底部時,停止電泳。按照如下圖順序放置濾紙、含蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠、NC膜。轉膜時候保持電流恒定為300mA,根據分子量大小決定轉膜時間,一般在90min左右。

    2.4.5封閉:配制封閉液,封閉液由1xTBST1xTBS溶液中加入0.1%Tween-20)和5%的脫脂奶粉配制而成。待轉膜完畢后,將膜放入封閉液封閉1.5小時。

    2.4.6一抗孵育:封閉液封閉完NC膜后,在1xTBST中去除殘余封閉液;根據Marker位置以及目標蛋白分子量切膜,敷上按說明書比例配制的一抗,4℃,過夜。

    2.4.7二抗孵育:孵育完一抗后,用1xTBST洗膜3次,每次10min。室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗,90min。

    2.4.8顯影:辣根過氧化物酶發光法,二抗孵育完后,1xTBST洗膜3次,每次10min。將新鮮配制的ECL發光液(A液、B1:1配制),均勻的滴到NC膜上,孵育2-3min,在CHEMIDOCXRS+成像系統中成像并保存結果。

    6.8RNA凝膠電泳和印跡(NorthernBlot)

    操作步驟主要試劑來源于RocheDIGRNALABELINGKIT試劑盒

    1.DNA模板制備:提取細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,根據雜交的目標片段設計引物,引物插入含T7、T3或者SP6聚合酶啟動子序列。PCR反應合成DNA模板,提純DNA模板。

    2.DIG-RNA標記:取1ugDNA模板,按順序加入以下試劑:LabelingMix4uL,TranscriptionBuffer4uL,RNApolymerase2uL,ddH2O定容至20uL;混勻所有試劑,42℃反應1小時;加入1uLDNaeseI,37℃孵育15min去除DNA模板;反應完成后,加入2uL0.2mmol/LEDTA,終止反應。

    3.檢測標記反應效率:取探針起始濃度為10ng/uLRNA探針標準品(DIG-labeledControlRNA)按照以下比例稀釋

    注:表格來源于DIGRNALABELINGKIT說明書。將已獲得的標記RNA和上述3-10號管中各取1uL點樣于帶正電荷的尼龍膜上;烤箱12030minRNA固定在尼龍膜上;通過洗滌、封閉、敷抗體步驟后,使用堿性磷酸酶發光底物CSPD曝光尼龍膜,根據待測樣品與標準品各點之間的亮度計算待測樣品的濃度。

    4. 配制NorthernBlot凝膠、電泳液

    所需溶液配方

    10x甲醛凝膠電泳(MOPS)緩沖溶液:200mMMOPS,50mMNaAc,20mMEDTA,NaOH調節pH=7.0

    20xSSC溶液配方:氯化鈉(NaCl175.3g,檸檬酸三鈉88.2g,加水定容至1000mL,高壓滅菌

    馬來酸緩沖液:0.1M馬來酸(MaleicAcid),0.15MNaCl,NaOH調節pH值至7

    洗滌緩沖液:馬來酸緩沖液基礎上加入0.3%Tween-20

    檢測緩沖液:0.1MTris-Hcl,0.1MNaCl調整pH=9.5

    封閉緩沖液:將試劑盒中10x封閉緩沖液稀釋至1x

    4.1配制2%甲醛變性凝膠:瓊脂糖1.8g,141.9mLMOPS,混合均勻,加微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解,然后加入37%甲醛8.1mL,混勻后灌膠。

    4.1RNA樣本中加入RNA上樣緩沖液,槍頭混勻,65℃變性10min,在無RNA酶的環境中電泳50V,1小時;電泳結束后,在紫外下觀察RNA完整性。

    4.2RNA轉膜與固定:轉膜前在20xSSC中洗滌2次,每次15分鐘;以20xSSC溶液為轉膜液,采用毛細管虹吸印跡法轉膜過夜,本實驗使用帶正電荷尼龍膜。轉膜完成后,2xSSC中簡單洗膜2次,120℃下烤尼龍膜30min。

    4.3雜交反應:配制雜交緩沖液DIGEasyHyb,加熱到68℃,將尼龍膜放入雜交緩沖液中振蕩30min;取新的雜交緩沖液DIGEasyHyb,加入地高辛標記的RNA探針(濃度約為100ng/mL),68℃下孵育過夜。雜交完成后用2xSSC,0.1%SDS室溫洗膜兩次,每次5min,再用0.1xSSC,0.1%SDS68℃下洗膜兩次,每次15min。

    4.4免疫檢測:將尼龍膜在封閉液中封閉30min;將堿性磷酸酶標記的地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-AP)按照1:10000的比例稀釋,室溫孵育尼龍膜30min;在洗滌緩沖液中洗滌兩次,每次15min;接著將膜在檢測緩沖液中平衡2-5min;將含RNA樣品的膜面向上,向膜上滴加CSPD至完全浸潤,室溫孵育約5min,將膜放入雜交袋中,防止膜干燥;采用CHEMIDOCXRS+成像系統成像,曝光30min,保存圖像。

    6.9熒光定量PCR1.RNA的提取

    1.1溶解細胞:在待提取RNA的組織或者細胞中加入Trizol,對于組織樣本,黃豆大小的組織塊,加1mLTrizol;對于細胞樣本,12孔板細胞加入400uLTrizol,6孔板細胞加入1mLTrizol。組織樣本需要研磨器研磨至組織樣本完全溶解(研磨器需高壓滅菌,DEPC水處理),細胞樣本在Trizol中約20min可完全溶解。

    1.2兩相分離RNA:在溶解了組織或者細胞的Trizol裂解液中按5:1的比例加入氯仿(1mLTrizol裂解液加入200uL氯仿),振蕩器振蕩30s,將氯仿與Trizol裂解液完全混勻。冰上靜置20min,然后12000rpm,4℃離心15min。離心后混合液分為三層,取上層水相液體轉移至新的離心管中,應避免取到中間層以及下層液體。

    1.3沉淀RNA:在取得的上層液體中加入等體積的異丙醇,以沉淀混合液中RNA。加入異丙醇后,輕柔混勻,靜置15min,然后12000rpm,4℃離心10min。通?稍陔x心管壁見到芝麻粒大小的白色沉淀,即為RNA。

    1.4洗滌RNA:去除上清后,加入DEPC水新配制的75%乙醇,每個樣本1mL,洗滌RNA沉淀,47500rpm,離心5min,棄上清。

    1.5小心吸取離心管內殘留液體,在空氣中干燥20min左右。待RNA完全干燥,肉眼可見RNA40uLDEPC水溶解,肉眼不可見者用20uLDEPC水溶解。提取的RNA保存在-80℃備用。

    2.RNA濃度測定:使用NanoDrop分光光度計測量RNA樣品的濃度與純度。

    3.逆轉錄cDNA合成:按照Takara貨號為RR037A的說明書配制反應體系,如下表

    注明:表格來源Takara貨號為RR037A說明書,檢測lncRNAGLS-AS表達時用Genespecificprimer。逆轉錄條件為:3715min逆轉錄合成cDNA(使用GeneSpecificPrimer時溫度為42℃);855s滅活逆轉錄酶活性;4℃停止反應。

    4.應用StepOnePlusReal-TimePCRSystem,RealTimePCR反應體系配制GreenPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)2×)10uLPCR前引物0.8uLPCR后引物0.8uLROXReferenceDye0.4uLcDNA模板2uLddH2O6uL本研究所用到的qPCR引物序列如下表NamePrimerSequencesGLSForward:5-TCCAGAAGGCACAG-3Reverse:5-AGACCAGCACATCATACC-3LncRNAGLS-ASForward:5-AGCCATGGACTCAATCGGAC-3Reverse:5-CTCTAAACAGCACAGCCCCA-3GLSpre-mRNAForward:5-CAGAGGGTAATACAGGA-3Reverse:5-CAGGATATGGGAGACAGA-3c-MycForward:5-AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC-3Reverse:5-GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC-3ADAR1Forward:5-GCCACTACCCTGTCTTCG-3Reverse:5-GACACCAGTTGACGCTTG-3DicerForward:5-TGCTATGTCGCCTTGAATGTT-3Reverse:5-AATTTCTCGATAGGGGTGGTCTA-3GAPDHForward:5-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3Reverse:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3

    5.定量PCR反應程序

    第一階段:預變性9530s1個循環第二階段:PCR擴增955s然后6030s40個循環第三階段:溶解曲線從60℃逐步升溫至951個循環

    6.定量PCR結果分析:

    每個標本做3個復孔,以每個標本GAPDH的表達作為內參,目的基因和內參基因的Ct值分別取均值。然后根據ΔCt=目的基因的Ct-Ct內參,分別計算實驗組和對照組的ΔCt值;ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組,對照組與實驗組的相對表達量=2-ΔΔCt。

    6.10免疫組化染色

    1. 將組織石蠟切片置于60℃的烘箱中1小時,然后浸入二甲苯脫蠟兩次,每次10分鐘。

    2. 用梯度酒精洗滌切片:100%,95%,80%,70%,每次5分鐘,然后蒸餾水洗滌5分鐘。3.然后將切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中,加入微波箱中,在微波爐中加熱至沸騰10分鐘,然后從緩沖液中取出載玻片,用蒸餾水沖洗兩次,然后用PBS沖洗。

    3. 向每張切片中加入一滴3H2O2并在室溫下孵育10分鐘以阻斷內源性過氧化物酶的活性。

    5.PBS溶液洗滌切片,然后在4℃下與抗GLS1100)抗體4℃孵育過夜。

    6.將載玻片與生物素化的抗-IgGCST,USA)一起作為第二抗體在室溫下孵育1小時。用PBS和蒸餾水進一步洗滌切片后,隨后使用新制備的DAB溶液(二氨基聯苯胺)直至組織切片適合觀察。

    6.18數據分析

    所有結果均以均值±SD表示。兩組之間差異的比較用t檢驗分析。LncRNAGLS-ASGLSmRNA之間的相關性使用皮爾森相關性(Pearsoncorrelation)分析。

    技術路線

    篩選出高表達或低表達的Smad         

    R-Smad高表達                  Anti-Smad低表達

    反義寡核苷酸阻斷                  轉染抑制型Smad載體

                   

    TGF-β1刺激氣道平滑肌細胞

     

    R-Smad的表達                      Anti-Smad的表達

    技術路線圖1 TGF-β1介導Smad信號通路的研究

                        MAPK抑制組

                Smad干預組

    哮喘組

                       合用兩者組

            

                       未干預組

    正常組

    技術路線圖2 Smad信號通路與MAPK信號通路協同調控研究

    技術路線:

                        早產大鼠高氧肺損傷模型

    caveolae caveolin酪氨酸磷酸化狀態

    (免疫沉淀、免疫印跡)

         

    Emmprin/MAPK p38                    TGF-β/SMAD

    信號通路研究 信號通路研究

    Emmprin、P38、磷酸化P38 TGF-β、TβR、SMAD、磷酸化SMAD

    表達(免疫印跡與Northern Blot     表達(Western Blot和Northern Blot)

    RT-PCR) TβRⅠ激酶活性(免疫沉淀和免疫印跡)

    實驗手段

    主要儀器

    力康HealForce臺式高速冷凍離心機上海力康生物醫療科技控股集團臺式常溫低速離心機TD6K上海盧湘儀離心機儀器有限公司微孔板迷你離心機BE-6100海門市其林貝爾儀器制造有限公司MiniStar10K/12K微型離心機湖南恒諾儀器設備有限公司電子天平AL104梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司MultiskanSky全波長酶標儀美國ThermoFisherScientific賽默飛世爾HeracellCO2細胞培養箱160i美國ThermoFisherScientificNanoDrop分光光度計美國ThermoFisherScientificZHJH-C1112B豪華型垂直流超凈工作臺華晨樂天生物實驗設備有限公司力康HFsafe-1200A2生物安全柜上海力康生物醫療科技控股集團HH-4數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司WGLL-125BE鼓風干燥箱天津泰斯特儀器有限公司立式高壓蒸汽滅菌鍋山東新華醫療器械股份有限公司賽默飛世爾900系列超低溫冰箱美國ThermoFisherScientific對開門冰箱廣東容聲電器股份有限公司液氮罐查特生物醫療(成都)有限公司臺式恒溫搖床美國ThermoFisherScientific脫色搖床常州榮華儀器制造有限公司超聲波細胞粉碎機中國寧波新芝生物科技有限公司Smart高純水機(智能型)上海力康生物醫療科技控股集團DYY-6C型電泳儀北京六一生物科技有限公司DYCZ-24K雙板垂直電泳儀北京六一生物科技有限公司DYCP-31C型瓊脂糖水平電泳槽北京六一生物科技有限公司CHEMIDOCXRS+成像系統美國BIO-RAD公司溫度梯度PCR儀德國WhatmanBiometra公司StepOnePlusPCR儀美國ThermoFisherScientific黑色載玻片濕盒江蘇南通海門市康泰儀器廠olympus激光共聚焦顯微鏡日本奧林巴斯株式會社OlympusBX51熒光顯微鏡日本奧林巴斯株式會社OlympusCX31普光顯微鏡日本奧林巴斯株式會社

    2.主要耗材

    T25/T75細胞培養瓶無錫耐思生物科技有限公司細胞培養皿無錫耐思生物科技有限公司細胞培養板無錫耐思生物科技有限公司50ml反應管無錫耐思生物科技有限公司無菌細胞爬片無錫耐思生物科技有限公司熒光定量PCR96孔板美國ThermoFisherScientificEppendorf手動單道移液器一套德國EppendorfKirgen通用性移液器吸嘴(Tip)上?七M生物技術有限公司各種型號EP管上?七M生物技術有限公司綠色蘆薈無菌手套海門市揚子醫療器械有限公司Transwell小室美國Corning公司

    3.主要試劑

    RPMI培養基1640美國GibcoOpti-MEM培養基美國Gibco胎牛血清(FBS)美國ScienCell公司青霉素-鏈霉素溶液中國碧云天轉染試劑Lipofectamine2000美國ThermoFisherScientific質粒與慢病毒構建上海吉凱基因小干擾RNAsiRNA)廣州市銳博生物科技有限公司Matrigel基底膜基質膠美國BD公司MTT細胞增殖檢測試劑盒中國碧云天SDS-PAGE凝膠制備試劑盒武漢谷歌生物科技有限公司Amersham蛋白轉印跡膜(NC膜)美國GEwhatman蛋白Marker美國ThermoFisherScientific兔抗GAPDH抗體美國CellSignalingTechnology瓊脂糖珠ProteinA美國CellSignalingTechnology鼠抗Dicer抗體英國Abcam兔抗ADAR1抗體美國ProteintechWesternBlot二抗美國CellSignalingTechnology兔抗GLS抗體美國Proteintech免疫熒光二抗中國碧云天

    qPCR逆轉錄與定量試劑日本Takara引物合成武漢擎科生物放線菌酮(CHX)中國碧云天MG-132Proteasome抑制劑中國碧云天地高辛Northern標記及雜交檢測試劑盒瑞士RocheEZ-ChIP試劑盒美國merckmilliporeFISHTagRNAMulticolorKit美國ThermoFisherScientificRNA免疫共沉淀試劑盒(RIP)美國merckmilliporeRNApulldown試劑盒美國ThermoFisherScientificStreptavidin-coupledDynabeads

    美國ThermoFisherScientific

    4.患者資料

    以及手術標本獲得本研究中涉及的患者臨床手術標本從武漢協和醫院胰腺外科獲得。獲取標本前與病人及家屬充分溝,病人及家屬表示同意,并簽署知情同意書。我們隨機選取了30例胰腺癌患者的腫瘤組織以及與之配對的癌旁組織,所選取患者術前未接受化學治療或者放療。選取患者中有男性21例,女性9例,我們根據美國NCCN胰腺癌治療指南,對患者選取相應合適的治療方案,包括胰腺十二指腸切除術或者I125粒子植入、胃腸吻合和膽總管空腸吻合等姑息手術。因此,手術標本通過包括手術切除獲得或者胰腺組織活檢兩種途徑獲得。我們在研究過程中未有涉及違反赫爾辛基宣言的地方。并且此項研究獲得了華中科技大學(中國,武漢)醫學研究倫理委員會批準。

    5.細胞來源

    本研究所使用的胰腺癌細胞系PANC-1、BxPC-3均購自于美國模式培養物集存庫(ATCC)。

    關鍵技術

    6.11蛋白免疫共沉淀(Co-IP

    1.提取胰腺癌細胞總蛋白,測蛋白濃度,使用碧云天購買的WesternIP裂解液,稀釋蛋白至1ug/ul。2.按照每1mL蛋白60uL體積的瓊脂糖珠比例,加入ProteinA瓊脂糖珠,4℃搖晃孵育1小時,去除非特異性結合蛋白。3.500uL上一步的蛋白裂解液,加入1ug目的蛋白(本實驗中使用anti-ADAR1/anti-Dicer)抗體,4℃搖晃孵育過夜。4.加入60uL體積的ProteinA瓊脂糖珠捕獲蛋白抗體復合物,加入瓊脂糖珠后,4℃搖晃孵育1小時,離心,棄上清,得到沉淀即為瓊脂糖珠、抗體、蛋白復合物。5.復合物用WesternIP裂解液洗滌三次,用50uL蛋白上樣緩沖液重懸瓊脂糖珠,沸水浴5-10min蛋白變性,即可用于WesternBlot檢測實驗結果。

    6.12染色質免疫共沉淀(ChIP

    1. 體內交聯(細胞內):將37%的甲醛加入到培養基中,使甲醛終濃度為1%,室溫孵育10min,加入10x甘氨酸,淬滅未反應的甲醛。

    2. 裂解細胞:棄上清,用含蛋白酶抑制劑的PBS洗滌細胞后,加2mL含有1xcocktailII的預冷PBS至細胞中,刮出細胞,離心收集細胞后加入含cocktailIISDS細胞裂解液。

    3. 超聲破碎DNA4-510秒脈沖,使交聯的DNA,破碎成長約200-1000個堿基對的DNA片段。

    4.免疫共沉淀(IP)交聯的蛋白質/DNA復合物:取100uL超聲破碎后的DNA,稀釋至1mL,加入60μL的蛋白G瓊脂糖,4℃振蕩孵育1小時,4000rpm,離心后保留上清,去除與瓊脂糖非特異性結合蛋白。實驗組加入目標抗體1ug,陰性對照組用IgG抗體,4℃,孵育過夜,然后加60uL蛋白G瓊脂糖,振蕩孵育1小時,4000rpm離心收集蛋白G-抗體-抗原-DNA復合物。

    5.洗滌蛋白G-抗體-抗原-DNA復合物:低鹽洗滌緩沖液,洗1次;高鹽洗滌緩沖液,洗1次;氯化鋰洗滌緩沖液,洗1次;TE緩沖液,洗2次。

    6.洗脫蛋白質-DNA復合物:每個樣品需要200uL的洗脫緩沖液:10uL20%SDS溶液,20uL1mol/L的碳酸氫鈉和170uL的無菌蒸餾水。加入洗脫緩沖液后,混勻,孵育15min,4000rpm,離心后收集上清。

    7.解交聯蛋白質/DNA復合物:上一步的上清中加入8uL5mol/LNaCl,65℃水浴鍋孵育5小時;加入RNA酶,37℃下孵育30分鐘;緊接著加入4uL0.5mol/LEDTA,8uL1mol/LTris-HCl,1uL10mg/mL的蛋白酶K,45℃水浴鍋孵育2小時。

    8.DNA純化:按照1:5體積的比例加入DNAbindingBuffer,通過收集管離心將DNA吸附到收集管自旋過濾器中,洗滌DNA,使用50uL洗脫緩沖液洗脫過濾器濾網上DNA,就是純化的DNA。

    9.ChIP結果檢測:PCR檢測配方:DNA2uL,ddH2O13.2uL,10xPCRBuffer2uL,2.5mmo/LdNTP1.6uL,目標片段前后引物各0.8ul(10mmol/L),Taq0.2uL5U/uL);PCR反應程序:943min預變性;緊接著30個擴增循環,條件為9420s變性,5945s退火,7230s延伸。

    10.取上一步的DNA片段的PCR產物,配制2%的瓊脂糖凝膠,DNA電泳觀察實驗結果。本研究用到的針對lncRNAGLS-AS啟動子DNA序列的引物序列如下:

    PrimerSequencesLncRNA-GLS-ASPromoterPrimer-1Forward:

    5-GGCTGCTCTTTGAATA-3Reverse:5-TGGCACCTCCTTTG-3Primer-2Forward:5-GGAGGCTGCTGGAGTA-3Reverse:5-TTTGTCTTGGGTTGGT-3Primer-3Forward:5-AAAGGCAACCTTGACCCA-3Reverse:5-TCCCTCCATAATGTGAGC-3Primer-4Forward:5-TCAAATTATACAATGCACGAGG-3Reverse:5-TTCTGACAACGGGAAGGA-3

    6.13RNA免疫沉淀(RIP)

    1. 細胞準備:預冷PBS洗滌細胞兩次,再加入適量PBS,細胞刮收集細胞,離心,得到細胞沉淀;使用適量RIP裂解液(RIPLysisBuffer)重懸細胞,槍頭吹打均勻使細胞充分裂解;每管取200uL裂解液進行下一步實驗。

    2.磁珠抗體結合:取50uL磁珠,加入0.5mLRIPWashBuffer,短暫漩渦振蕩后分離磁珠,重復兩次;用100uLRIPWashBuffer重懸磁珠,向其中加入3ug目的抗體。室溫條件下振蕩孵育30min;磁力架分離磁珠,0.5mLRIPWashBuffer洗滌磁珠兩次。

    3.免疫沉淀磁珠/蛋白/RNA結合復合體:向磁珠/抗體復合物中加入100uL細胞蛋白裂解液,同時加入RIP免疫沉淀緩沖液(RIPImmunoprecipitationBuffer);4℃搖床孵育過夜;磁力架分離磁珠/蛋白/RNA復合體,棄上清,RIPWashBuffer洗滌3次。

    4.RNA分離:向上一步提取的磁珠中加入107uLRIPWashBuffer,15uL10%SDS18uLproteinaseK,總體積150uL;55℃孵育30min,使蛋白充分消化,RNA從復合物上分離出來。

    5.RNA純化:上一步孵育完成后,取上清,加入250uLRIPWashBuffer,再加入400uL的苯酚:氯仿:異戊醇(試劑盒提供);4℃,12000rpm,離心10min;取上清350uL置于新的無酶離心管中;加入400uL氯仿,漩渦振蕩,4℃,12000rpm,離心10min,取上清300uL;繼續按照常規RNA提取步驟提純RNA;最后用20uL無酶水(DEPC水)重懸。6.RNA檢測分析:本研究中使用定量PCR檢測。

    6.14雙熒光素酶報告基因檢測啟動子活性

    1.構建質粒:將GLS基因與lncRNAGLS-AS基因轉錄起始位點上游啟動子堿基作為目的片段克隆到pGL3載體質粒上,構建成熒光素酶報告質粒;同時突變其中感興趣的片段,構建突變型(Mutant)熒光素酶報告質粒。

    2.質粒轉染:按照質粒轉染的步驟將上述報告基因轉染進入細胞,同時應轉染攜帶海腎熒光素酶的質粒pRL-TK用作內參熒光。

    3.檢測:使用美國Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒,步驟如下:

    3.1試劑準備:配制LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制,將10mLLuciferaseAssayBuffer全部加入LuciferaseAssaySubstrate中,分裝凍存于-80℃,每次按需求取用;使用前配制1xPassiveLysisBuffer(1xPLB),用ddH2O或者PBS稀釋5xPassiveLysisBuffer1x。使用Stop&GloBuffer50xStop&GloReagent稀釋至1x。

    3.2檢測試驗步驟:

    使用96孔板培養細胞,每個樣品設置5個復孔,轉染后達到檢測時間,去除待檢測細胞培養基,1xPBS洗滌3次,加入配制好的1xPLB裂解液至細胞中,20uL每孔,室溫輕柔搖動96孔板孵育30min,保證細胞完全充分裂解;每孔細胞裂解液中加入100uLLARII,稍微搖勻,使用多功能酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶活性強度;每孔加入100uL1xStop&GloReagent,終止螢火蟲熒光素酶反應,同時激活海腎熒光素酶活性;再次使用多功能酶標儀檢測海腎熒光素酶活性,記錄數值。

    3.3結果計算:

    啟動子活性強度=螢火蟲熒光素酶活性強度數值/海腎熒光素酶活性數值,取復孔平均值。

    6.15RNA熒光原位雜交

    該部分實驗使用購買于美國ThermoFisherScientific公司的FISHTagRNAMulticolorKit試劑盒,按照如下步驟操作。

    1.體外合成氨基結合的RNA探針:根據實驗需要,確定探針標記的位置,設計引物,在下游引物根據需要選擇插入T7、T3或者SP6啟動子,PCR合成探針的DNA模板,應使最終探針長度在500nt左右。按照以下配方體外轉錄合成RNA探針:試劑需要量ddH2O不含核酸酶加至總體積20uL5X逆轉錄緩沖液(T3/T7,或者SP64uL二硫蘇糖醇(DTT1-2uL10XRNA核酸mix2uLPCR獲得的線性DNA模板1ugRNaseOUTinhibitor1uLRNA聚合酶(T3,T7或者SP61uL37℃孵育1小時,然后加入1ulDNase,37℃孵育15min,分解DNA模板,加入79uL無酶水劇烈振蕩10s,滅活DNase。然后,馬上進行RNA提純:加400ulBindingbuffer進入上述反應管中,按照離心柱提取核酸的步驟提取RNA,最后收集管中得到的便是提純的胺基結合的RNA。

    2.染料標記結合氨基的RNA探針:將1ugRNA65℃水浴鍋變性5min,然后置于冰上,加入試劑盒中準備的碳酸氫鈉溶液3uL。將染料用2uLDMSO溶解,加入到RNA中,室溫避光孵育1h,然后使用試劑盒提供的方法與試劑提純RNA,提純的RNA可直接用于熒光原位雜交實驗,應避光保存在-80℃冰箱。

    3.RNA熒光原位雜交實驗

    3.1預雜交:常規固定樣品,0.5%TritonX-100透化處理樣品,根據樣品(組織或者細胞)種類不同,可選擇濃度在5-50ug/ml之間的蛋白酶K處理樣品。然后使用預先配制好的預雜交緩沖液55℃預雜交樣本1小時。預雜交緩沖液的配方為:50%甲酰胺與5XSSC,雜交液中破碎的鮭魚睪丸DNA濃度為100ug/ml,肝素濃度為50ug/mL,Tween-20濃度為0.1%。

    3.2雜交:將RNA探針溶解于雜交緩沖液中,使其濃度為1ug/ml,探針孵育前應在80℃水浴鍋中變性2min,然后置于冰上5min,然后去除樣品中的雜交緩沖液,加入含探針的雜交緩沖液,55℃孵育16-20小時。

    3.3雜交后:收集探針/雜交緩沖液,凍存于-20℃,探針可反復使用數次。使用預雜交緩沖液,在55℃洗滌雜交后樣品兩次,每次半小時。再用50%PBT50%雜交緩沖液混合液室溫孵育10min,然后PBT溶液漂洗3次,每次5分鐘。在樣品表面滴上抗淬滅封片劑,蓋上蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察。

    6.16RNA-RNApulldown實驗

    1.根據所需要轉錄的RNA序列設計引物,并將體外轉錄所需的T3/T7/SP6啟動子插入到引物中,PCR合成DNA模板。按照體外轉錄的步驟使用合適的RNA聚合酶(T3/T7/SP6)合成目的RNA,提純合成的RNA。2.生物素標記RNA:取5uLRNA,為打開RNA的二級結構,加入2uLDMSO溶液,在反應管中,85℃水浴5min,置于冰上。按照下列體系配制標記液:10xRNA連接酶反應液3uL,RNA酶抑制劑1uL,生物素化二磷酸胞嘧啶1uL,T4RNA連接酶2uL,30%聚乙二醇15uL,未標記RNA5uL,ddH2O3uL;靹蛏鲜龇磻w系,PCR儀內16℃孵育4h或過夜。待上述反應結束后,加入70uL無核酸酶的ddH2O。

    3.提純生物素標記的RNA:向每個反應中加入100uL試劑盒中的氯仿:異戊醇,以提取生物素化標記的RNA。振蕩混合物,在4℃,12000rpm離心5min。收集上層水相液體(內含RNA),并轉移至無核酸酶的試管中;加入10uL5mmol/LNaCl,1uL糖原和300uL100%乙醇,在-20℃下沉淀≥1小時;在4°C下以12000rpm,離心15min,棄上清,保留沉淀,70%乙醇洗滌提純的RNA,晾干后加20uLddH2O溶解。

    4.使用生物素標記的RNA進行RNA-RNApulldown實驗

    4.1準備細胞裂解液。

    4.2清洗鏈霉親和素偶聯的磁珠:使用試劑盒提供的洗滌液BindingandwashingBuffer(2X),將磁珠洗滌2-3次,使磁珠能更好的跟生物素標記的RNA結合。

    4.3磁珠與生物素化RNA結合:向洗滌后的磁珠中加入200uLBindingandwashingBuffer2X()濃度為5ug/uL),加入20uLRNA,加380uLDEPC水定容至800uL。室溫輕柔振蕩孵育30min,使磁珠與生物素化RNA充分結合,用磁力架分離磁珠/RNA復合物,棄上清,BindingandwashingBuffer2X)洗滌3次。

    4.4目標RNA與磁珠/RNA復合物結合:將提取的細胞裂解液加入到上一步已處理好的磁珠中,同時加入RNase抑制劑;4℃旋轉振蕩2小時使磁珠與細胞裂解液充分接觸;磁力架分離磁珠,棄上清,得到磁珠/RNA復合物與目標RNA的結合體;按照步驟提取RNA,然后NorthernBlot檢測目標RNA。

    6.17裸鼠異種移植瘤模型

    1. 細胞準備:將細胞分別轉染實驗組與對照組慢病毒,嘌呤霉素篩選并鑒定穩定表達的細胞株,將細胞接種到培養瓶中,使用T75的培養瓶準備種植瘤所需細胞。

    2. 裸鼠準備:從北京華阜康生物科技股份有限公司購買裸鼠,雄性,6周齡,隨機分為對照組與實驗組,每組6只;裸鼠應在新環境中喂養3-5天再接種細胞。

    3.接種細胞:皮下種植瘤:裸鼠接種部位皮膚用75%酒精消毒,用1mL注射器吸取100uL細胞懸液(4*106個細胞),將細胞注射至小鼠背部皮下;轉移瘤:吸取200uL細胞懸液(1*106個細胞),將細胞經尾靜脈注入小鼠體內。

    4.觀察、記錄實驗結果:每日觀察小鼠的飲食、活動以及皮膚健康狀態,每隔3天用游標卡尺記錄腫瘤的大小,繪制腫瘤生長曲線,腫瘤體積計算公式V=0.5*(length)*W2(width)。3周時處死小鼠,剝離種植瘤,取小鼠腫瘤組織提取RNA,PCR檢測感興趣指標變化;觀察轉移瘤模型小鼠的肝臟、肺組織,進行H&E染色。

    3.本項目的特色與創新之處;

    (1)將呼吸學與病理學、病理生理學、分子生物學和中西藥物學交叉結合,體內實驗和體外實驗相結合進行重大疾病的研究;

    (2)率先探討Smad信號通路在哮喘中的作用,探討其與MAPK信號通路是否協同調控TGF-β,協同參與氣道重塑,通過氣道平滑肌細胞培養和體外干預實驗研究證實;

    (3)首次研究牛膝多糖和丁地去炎松對Smad信號通路和氣道重塑的影響,并為 牛膝多糖在兒童哮喘中的應用提供實驗依據,對于完善兒童哮喘治療方案具有重要意義。

    5.年度研究計劃及預期研究結果(包括擬組織的重要學術交流活動、國際合作與交流計劃等)。

    2006.1— 2006.12  觀察哮喘大鼠Smads表達情況,探討其與氣道重塑的關系;

    2007.1— 2007.8   TGF-β1介導Smad信號通路的研究

    2007.9—2008.6    Smad信號通路與MAPK信號通路協同調控的實驗研究

    2008.7—2008.12   總結、申請鑒定和成果報獎。

    【預期研究成果】

    (1) 闡明TGF-β/Smad信號通路在哮喘氣道重塑中起著重要作用;

    (2) 闡明哮喘發病中Smad 信號通路與MAPK信號通路具有協同作用,協同調控TGF-β;

    3) 揭示牛膝多糖、丁地去炎松對Smad信號通路具有調控情況,參與調控氣道重塑。

    利用研究結果的計劃

    爭取在國內核心期刊、國外雜志上發表論文5-6篇(SCI1-2篇),參加全國會議和國際會議交流并進行推廣。申請成果鑒定并以科研成果申報省級醫學科技進步獎或省級科技進步獎。通過研究成果將深化哮喘發病理論,闡明藥物作用機制。

    理論上的創新:

    研究Emmprin/MAPK p38信號通路在器官發育和組織病理損傷中的作用,國內外尚無文獻報道。

    本課題研究caveolin對Emmprin/MAPK p38、TGF-β/SMAD共調節機制,將為早產兒高氧肺損傷發病機制開辟新的研究領域,并為其防治開拓新思路。

    方法上的創新:

    以在體組織為研究對象,應用免疫熒光雙重標記共聚焦顯微鏡技術研究caveolin/Emmprin、caveolin/TβRΙ共定位,國內外未見文獻報道,可望為深入研究小窩蛋白對信號轉導的調控機制開辟新途徑。

    年度研究計劃及預期研究結果。

    年度研究計劃及預測進展

      本課題研究內容預計用3年時間完成.

       2004年1月~8月

    ①購買所需試劑。②建立預實驗動物模型。③進行各項預實驗。

       2004年9月~2005年2月

    ①建立動物模型。②完成標本的收集。

       2005年3月~7月

                    完成MMPs、TIMPs、TGF-β、TβRΙ、SMAD2及其mRNA表達的研究,并進行階段性總結。

       2005年8月~2005年12月  

                 完成caveolin-1表達和caveolin-1/TβRΙ共定位研究,并進行階段性總結。

       2006年1月~2006年6月

           完成caveolin-1的酪氨酸磷酸化狀態研究,并進行階段性總結。

       2006年7月~12月  

    研究數據資料分析、總結、論文撰寫及成果鑒定。

     預期研究成果

    本項目所建立的早產新生大鼠慢性高氧肺損傷模型,不僅為本課題提供了研究對象,而且為研究高氧肺損傷后肺ECM重建提供了模型。

    本研究可望為闡明早產兒高氧肺損傷機制提供新的線索:⑴高氧暴露下MMP誘導劑/抑制劑失衡是高氧肺損傷MMPs增加,ECM重建紊亂的主要原因。⑵高氧暴露使質膜小窩表達或功能異常,從而影響Emmprin/MAPK p38和TGF-β/SMAD兩條信號通路整合,繼而導致MMPs增加,ECM重建紊亂。本研究內容也可能為預防和干預高氧肺損傷提供理論依據。

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